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今天要分享的一篇是于5月24号发表在Nature Communications[17.69]的"Single-cell analysis of gastric signet ring cell carcinoma reveals cytological and immune microenvironment features“，胃印戒细胞癌的单细胞分析揭示细胞学和免疫微环境特征。
|摘要
背景：胃印戒细胞癌（GSRC）是胃癌（GC）的一种特殊亚型，预后较差，但缺乏对GSRC的深入和系统研究。
方法：我们执行单细胞 RNA 测序来评估 GC 样本，识别其中的印戒细胞癌 (SRCC) 细胞。
结果：Microseminoprotein-beta (MSMB) 可作为标记基因，指导中/低分化腺癌和印戒细胞癌 (SRCC) 的鉴定。SRCC细胞中上调的差异表达基因主要富集在异常激活的癌相关信号通路和免疫应答信号通路中。SRCC 细胞还显着富集丝裂原活化蛋白激酶和雌激素信号通路，它们可以在正反馈回路中相互作用和促进。此外，SRCC细胞显示出较低的细胞粘附和较高的免疫逃避能力以及免疫抑制微环境，这可能与GSRC相对较差的预后密切相关。
结论：综上所述，GSRC表现出独特的细胞学特征和独特的免疫微环境，可能有利于准确诊断和治疗。
|过程
1. scRNA-seq 概述和鉴定癌旁组织和 GA 组织中的主要细胞类型
▲ 图1
2. 鉴别恶性和非恶性上皮细胞
如前所述，细胞簇 5、7、15 和 19 被 鉴定为上皮细胞簇。通过进一步对上皮细胞的细分，我们获得了20个亚群（图2a）。根据标记基因 ，这20个亚群被重新划分为 5 个亚群：癌细胞（表达CLDN4、REG4、TTF3、CEACAM6）、粘液细胞（表达TFF1、MUC5AC、TFF2、MUC6）、主细胞（表达PGA3、PGA4）、壁细胞（表达ATP4A、ATP4B）和内分泌细胞（表达 CHGA 和 CHGB）（图 2b）。具体而言，亚群6、11、12、13被鉴定为癌细胞即中/低分化腺癌（M/PDA）细胞，亚群14、16被鉴定为主细胞，亚群18、19被鉴定为壁细胞，亚群9被鉴定为内分泌细胞，其他亚群被鉴定为作为粘液细胞（图 2c，d）。
▲ 图2
在低分化腺癌伴印戒细胞癌（PDSRCC）和 GSRC 中，粘液细胞的比例显着增加（图 2e）。根据上述发现，对粘液细胞标志物进行免疫荧光分析，发现这些标志物也在SRCC细胞中表达（图2f）。SRCC细胞含有大量粘液，因此，这些细胞可能被鉴定为粘液细胞。所以，为了进一步区分粘液细胞和 SRCC 细胞，我们考虑了组织来源。亚群 1、4、8 和 15 独立地来源于癌组织并被鉴定为 SRCC 细胞，亚群 0、2、3、5、7、10 和 17 被 鉴定为粘液细胞（图 2g、h）
为了验证划分细胞亚群的准确性，执行了以下步骤。首先，为了便于分析，将主细胞、壁细胞和内皮细胞归类为非恶性上皮细胞，它们的鉴别比较清楚。比较非恶性上皮细胞和M/PDA细胞的癌症相关评分，两组之间存在显着差异（图3a）。在 SRCC 和粘液细胞之间也发现了相同的结果（图 3b）。其次，InferCNV 是一种使用 scRNA-seq 数据分析肿瘤细胞拷贝数变异 (CNV) 的工具。基于 InferCNV 分析，M/PDA 细胞的 CNV 显着高于非恶性上皮细胞和粘液细胞，而 SRCC 细胞的 CNV 低于粘液细胞（图 3c，补充图 2）。此外， 亚群6、11、12 和 13 的 CNV 分数相对较高，这些亚群被鉴定为具有典型恶性肿瘤特征的 M/PDA 细胞（图 3d）。SRCC 细胞的 CNV 评分低于 M/PDA 和粘液细胞，但高于非恶性上皮细胞（图 3e）。最后，火山图分析显示，与非恶性上皮细胞相比，REG4、S100A10、TSPAN8、OLMF4 和 PHGR1 在 M/PDA 细胞中上调（补充图 3a）。根据 GSVA 的结果，M/PDA 细胞主要富集与癌症相关的信号通路，这些通路有助于肿瘤的生长、增殖和转移（补充图 3b，补充数据 1）。SRCC 细胞富集了肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、核因子-κB (NF-κB) 和转化生长因子-β (TGF-β) 信号通路等信号通路，它们对癌症发展至关重要（图 3f）。
▲图3
3.scRNA-seq揭示了SRCC的特征
随后的分析表明，SRCC 细胞可以分为四个亚群（图 4a）。根据热图分析，这些SRCC 细胞之间存在显着的异质性（图 4b）。然而，在四个亚群中，发现了一些共同的高表达基因，如CLDN18、PHLDA2、ATF3、HBEGF、SYTL2、PGC和LYZ，它们可能参与了GSRC的发生和发展。
▲ 图4
基因集富集分析（GSEA）结果表明，在SRCC细胞中上调的基因主要富集在免疫反应、细胞增殖相关信号、 雌激素反应信号和胆固醇稳态信号中（图 4c）。MSMB 被发现是 GSRC 的潜在标记基因。MSMB的表达水平与SRCC细胞亚群基本一致。MSMB 在 M/PDA 细胞中表现出基本无表达/低表达（图 4d、e）。scRNA-seq 结果表明，MSMB 在 SRCC 细胞中的表达水平高于粘液细胞和 M/PDA 细胞（图 4f）。在相应的细胞系中进行验证。SRCC 细胞系 NUGC4 表现出比低分化 MKN-45 腺癌细胞系更高的 MSMB 表达水平（图 4g，h）。使用IHC进行验证，结果证实MSMB在SRCC细胞中的表达水平高于M/PDA细胞，但低于癌旁组织的胃中心凹增殖区（图4I）。总之，这些数据支持 SRCC 细胞中的高 MSMB 表达水平。
4.M/PDA与SRCC细胞的异同
临床上，M/PDA与GSRC的生物学行为存在显着差异，这些差异主要表现在肿瘤实质。为了阐明这些差异，我们分析了 两者的差异基因（ DEGs，图 5a）。通过对上调DEGs的富集分析 发现，SRCC细胞中上调的基因主要富集异常活跃的癌症相关信号通路并与免疫逃逸的信号通路密切相关（图5b，c）。在细胞培养中进行了相应的验证（图5d、e）。M/PDA细胞具有高增殖和免疫监视能力，而SRCC细胞具有低细胞粘附和高免疫逃逸能力 （图 5f）。
▲ 图5
5.B细胞在M/PDA和GSRC中的浸润特性
使用标记基因（图 6a）将来自簇 3 和 4 的 B 细胞重新聚类为 16 个亚群（图 6b）。其中，亚群 1、2、4、6、8 和 12 被鉴定为粘膜相关淋巴组织衍生 B (MALT-B) 细胞；亚群 0、3、7、14 和 15 被 鉴定为滤泡 B 细胞；亚群 9、10、11 和 13 被定义为浆细胞；亚群 5 被 鉴定为记忆 B 细胞。从每个B细胞亚群中提取前10个高表达基因形成热图后，发现MALT-B细胞主要表达IgA相关基因，而浆细胞主要表达IgG相关基因（图6c）。随后对各亚群的标志基因进行富集分析，发现MALT-B与浆细胞具有相似的功能，主要与免疫反应、B细胞活化、参与补体活化等有关。然而，滤泡 B 细胞具有相对较弱的免疫反应（图 6d）。
▲ 图6
样本分析显示，MALT-B 细胞浸润 主要在癌旁组织 MDA、PDA 和 PDSRCC 中浸润，而 滤泡B 细胞 主要在GSRC 浸润。癌组织分析显示，MALT-B和记忆B细胞是 MDA 和PDA的主要浸润细胞，滤泡B和记忆B细胞是 PDSRCC 和 GSRC 的主要浸润细胞。SRCC 比例的增加伴随着 MALT-B 细胞比例的减少和滤泡 B 细胞数量的增加，这与 GSRC 中的癌旁组织高度一致（补充图 4d）。与M/PDA相比，GSRC中肿瘤浸润性滤泡B细胞更高，差异无统计学意义；类似地，M/PDA 和 GSRC 之间的肿瘤浸润性 MALT-B 细胞没有差异（图 6e）。与M/PDA相比，GSRC中浸润的滤泡B细胞（表达CD74）的IHC评分更高，差异有统计学意义；GSRC 中肿瘤浸润性 MALT-B 细胞（表达 JCHAIN）的 IHC 评分较高，但差异无统计学意义（图 6f，补充图 5）。 为了深入了解 B 细胞亚群之间的进化关系，我们进行了 Monocle 算法分析。来自不同亚群的大多数细胞根据其基因表达的相似性进行聚类，而不同亚群以假时间聚类。B 细胞分为两个分支：一个由 滤泡 B 细胞和记忆 B 细胞；另一个由 MALT-B 细胞和浆细胞组成（图 6g）。总而言之，与M/PDA相比，B细胞亚群在GSRC中表现出独特的浸润特征，主要是滤泡B细胞。此外，滤泡B细胞的免疫反应相对较弱；这也可能是 GSRC 预后不良的原因之一。
6.M/PDA和GSRC中T细胞的浸润特性
来自 0、1、13 和 14 个簇的 T 细胞被重新聚集到 14 个独立的亚簇中（图 7a）。使用标记基因（图 7b）将亚群细分为 10 个细胞亚群（图 7c）。其中， 来自簇0 的细胞被鉴定为 CD4-Th17 细胞；来自簇 1 的 细胞被 鉴定为 CD4-Tn 或中央记忆 T (Tcm) 细胞；来自簇 2、3、4 和 10 的 细胞被 鉴定为 CD8-Teff 细胞；来自簇 5 的 细胞被 鉴定为 CD8-Tex 细胞；来自簇 6 的 细胞被 鉴定为 CD4-Treg 细胞；来自簇 7 的 细胞被 鉴定为幼稚 T 细胞；来自簇 8 的 细胞被 鉴定为 CD8-Tem 细胞；来自簇 9 的 细胞被 鉴定为 pro-T 细胞；来自簇 11 的 细胞被 鉴定为自然杀伤 (NK) 细胞，而来自簇 12 的 细胞被 鉴定为其他细胞。
▲ 图7
通过对样本的分析发现，CD4-Th17、CD4-Tn或Tcm和CD8-Teff细胞主要浸润于癌旁组织，表现出免疫功能。CD4-Treg细胞在癌组织中的浸润比例明显高于癌旁组织，尤其是在GSRC中。同时，GSRC 的浸润性 CD8-Teff 细胞比 M/PDA 少（图 7d）。与M/PDA相比，GSRC中浸润CD4-Treg细胞的比例更高，差异无统计学意义。GSRC中浸润CD8-Teff细胞的比例较低，差异无统计学意义（图6e）。与M/PDA相比，GSRC浸润CD4-Treg细胞（表达FOXP3）的IHC评分更高，差异有统计学意义； GSRC 中浸润性 CD8-Teff 细胞（表达 KLRD1）的 IHC 评分较低，差异具有统计学意义（图 6f，补充图 5）。总的来说，GSRC中的T细胞亚群表现出独特的浸润特征，即CD4-Treg细胞浸润增加、CD8-Teff细胞浸润减少，主要表现为免疫抑制微环境。
|总结
总之，本研究通过 scRNA-seq 分析了来自 5 名患者的癌旁组织的 32,456 个单细胞和来自 13 名患者的癌组织的 117,326 个单细胞。我们鉴定出了 SRCC 细胞。MSMB 可作为指导 SRCC 和 M/PDA 细胞鉴定的标志物。SRCC中上调的DEGs主要富集在 MAPK、雌激素信号通路、异常激活的癌症相关信号通路和免疫反应信号通路中。SRCC 细胞表现出较低的细胞粘附和较高的免疫逃避能力，以及免疫抑制微环境，这可能与 GSRC 相对较差的预后密切相关。总体而言，与M/PDA细胞相比，GSRC细胞具有独特的细胞学特征和独特的免疫微环境，这可能有利于GSRC的精准医疗。
注释特定细胞亚群
结合位置信息分析相关功能及marker
湿实验不多
END~
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