人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒
【生产厂家】潮州凯普生物化学有限公司
【批准文号】国药准字S0011
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】30人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【药品名称】
人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒
【英文或拉丁名】
HPV GenoArray test kit
【汉语拼音】Renrutouzhuangliu Bingdu Hesuan Fenxing JianceShijihe
【主要成分】
PCR试剂盒组成（30人份用量，-20℃储存）
规格
PCR Mix
600μl
DNA Taq ( 5U/μl )
24μl
阳性对照（HPV 1 8 型）
25μl
阴性对照(超纯水)
200μl
杂交试剂盒组成 （30人份用量，4℃储存）
规格
杂交液
120ml
封阻液
30ml
酶标液
15ml
溶液A
100ml
溶液B
100ml
溶液C
22ml
杂交膜
30人份
NBT/BCIP
1片/瓶×2
【用途】
用于临床尖锐湿疣体表面脱落细胞、妇女宫颈细胞及宫颈粘液标本中21种HPV病毒DNA的分型检测。可作为HPV感染的辅助诊断。
【试验原理】
本试剂盒系由人乳头状瘤病毒（HPV）核酸扩增试剂、HPV杂交检测试剂等组成，采用基因扩增技术及导流杂交原理，通过反向点杂交检测扩增产物与包被有型特异性探针膜杂交结果，采用碱性磷酸酶系统定性检测，从而对21种HPV基因型（6、11、53、16、18、31、33、58、35,39,45,51,52,56,59,66,68,42,43,44及CP8304）进行分型检测。
【适用仪器】
1、PCR扩增仪：PE Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600
GeneAmp PCR System 9700 (使用9600模式)
PTC-200 (MJ Research)
Eppendorf Master ThermalCycler
2、HybriMax医用核酸分子快速杂交仪
【样本要求】
检查前准备：
1、3天内不使用阴道内药物或对阴道进行冲洗。
2、24小时内不应有性行为。
3、检查应在非月经期内进行。
HPV DNA具体取样步骤：
1、由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。
2、将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈。
3、慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，拧紧瓶盖。
4、送检样本，如若不能马上送检样本，请于4℃保存，请在2个星期之内进行检测。
【试验方法】
1．DNA分离提取:(本操作为建议方法)
首先，取保存有宫颈组织标本的细胞保存液2ml，以13,000g离心15分钟，弃上清液后加入200μl PBS缓冲液悬浮沉淀。然后，利用QIAGEN公司的QIA Mini试剂盒抽提DNA，具体操作步骤详见QIA Mini试剂盒说明书。最后，取5μl抽提的DNA样品进行PCR扩增，剩余DNA样品存储于-20℃备用。
注:建议用于HPV基因分型检测的DNA纯度(A260/280)需要达到1.7-2.0之间，DNA浓度为≥3ng/μl；
2．PCR扩增:
将PCR-Mix充分混匀后，按下列要求配制成25μl/人份扩增反应体系并混匀，每一批次同时扩增阳性对照和阴性对照各一份。
PCR-Mix
DNA Taq
DNA模板
1 人份用量
19.25 μl
0.75 μl
5 μl
10人份用量
192.5 μl
7.5 μl
5 μl/份
20人份用量
385.0 μl
15.0 μl
5 μl/份
30人份用量
577.5 μl
22.5 μl
5 μl/份扩增程序(以PE 9600为例，温度速率为1℃/sec)
注意:在每次检测中设置阴、阳性对照品。
3．杂交过程:（每个检测样品占用分隔室一孔，以下试剂用量为单孔用量）
实验前准备:
1.将杂交检测试剂平衡至室温；
2.杂交液在使用前预热至45℃；
3.若溶液B中出现沉淀，可以加热至45℃溶解；
4.使用前将10ml溶液C加入NBT/BCIP药片瓶中振荡溶解，配成显色溶液。未使用的显色溶液，旋紧瓶盖避光4℃保存。
杂交仪前准备:
1.打开杂交仪的电源；
2.在杂交仪后面的废液出口处安装好废液缸；
3.根据控制面板指示，选定[Manual Mode]，按[Enter]键进入温度设定界面，输入温度为45℃后，再按[Enter]键确认并进行升温；
4.用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板并打开水泵，排出多孔板上面的水分后关闭水泵；
5.将与实验样品数相对应孔数的塑料薄膜放置在金属多孔板上；
6.用镊子将杂交膜放置在塑料薄膜对应开孔上，如有多余开孔则用parafilm封口膜覆盖，这一步要确保杂交膜湿润且沒有气泡；
7.在杂交膜上面放置硅胶封圈和分隔室；
8.固定好压扣盖（注意:固定时应对准反应室尾部两个孔按下往前推到底）
9.开泵泵走残留在膜上的水珠后关泵。
PCR产物杂交过程:
1.取PCR产物20μl在95℃加热5分钟然后立即冰水浴至少2分钟；
2.在杂交前已准备好的条件下,于45℃进行杂交实验；
3.在杂交孔内加入1ml预热至45℃的杂交液，盖上盖板温育至少2分钟后开泵排出预杂交的杂交液，然后关泵；
4.把步骤1制备的已变性DNA样品溶液加入0.5ml预热至45℃的杂交液，混匀，然后加在薄膜上，盖上盖板温育5分钟后开泵进行导流杂交。
5.在45℃条件下，用预热至45℃的杂交液冲洗膜三次，每次0.8ml；
6.关掉水泵。
注意:以上操作均应保持杂交液温度为45℃。
4．显色过程:
1.按[ESC]键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为25℃后按[Enter]键确认
2.用0.5ml封阻液封闭膜，开泵排出封阻液，然后关泵，再用0.5ml封阻液封闭5分钟；(此步不必降到25℃就可进行)；
3.开泵，泵出封阻液，关泵；
4.在温度为25℃(±3℃)时，加入0.5ml酶标液，温育3.5分钟；
5.开泵泵出所有溶液；
6.设定温度为36℃；
7.用溶液A彻底洗膜4次,每次0.8ml；
8.加入0.5ml NBT/BCIP溶液，盖上盖板显色3至5分钟；
9.开泵泵出NBT/BCIP溶液；
10.用溶液B洗膜三次，每次1ml，再用2ml蒸馏水漂洗；
11.关泵,打开压扣盖,拿走分隔室,用镊子取出杂交膜并放在吸水纸上；
12.在一个小时内分析结果。(可配合凯普专用阅读仪器及专业软件对结果进行分析)。
【质量控制】
1.本试剂盒所得HPV DNA杂交结果是定性结果。
2.杂交结果阳性成立：杂交膜条上的Biotin对照点显色、同时HPV杂交点也显色。检测结果阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点。（见图1）
3.杂交结果阴性成立：杂交膜条上只有Biotin对照点及内对照（IC）点显色。
4.杂交结果为何种HPV阳性感染：根据膜条HPV分型分布图（见图1），判断阳性点为何种HPV病毒类型。
5．如果有一个或一个以上HPV分型点为阳性代表该类型HPV检测阳性。结果为单一或混合HPV感染。（见图2）
【结果常见问题分析】
1．弱/无信号
* 样品中HPV DNA的含量很低。
* 确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变性PCR产物。
2．IC及HPV分型阳性点不显色(如右图)
* 可能存在PCR抑制剂，可用1：10或1：40稀释DNA模板重复PCR过程，然后再杂交分析。
3．IC点弱/不显色，但HPV分型阳性点显色（如右图）
* 由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反应产生竞争性抑制，此现象出现时如HPV分型点
