丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒
【生产厂家】深圳市匹基生物工程有限公司
【批准文号】国药准字S0078
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】48份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【正文】
丙型肝炎病毒（HCV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒
前言
本试剂盒利用一对丙型肝炎病毒（HCV）的特异性引物、一个特异性荧光探针，配以RT-PCR反应液、RT-PCR酶、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，采用RT-PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术，通过荧光信号的变化检测丙肝病毒RNA；同时在体系中加入内标RNA，实现对待检测样本RNA的提取、逆转录及PCR反应扩增效率等过程的全程监控，对样本中可能存在的影响PCR反应体系的各种因素进行修正，从而实现对血浆样本中HCV RNA的定量测定。本品用于人血浆样本中的HCV RNA的定量测定，适用于丙型肝炎的辅助诊断，以及抗病毒药物疗效的观察。
试剂盒组成
组成成份（48tests/盒） 体积
样本处理试剂
裂解液4ml×2管
Carrier RNA 100ul×1管
内标RNA250ul×1管
核酸扩增试剂
HCV RT-PCR反应液（用于RotorGene，Lightcycler2.0等仪器）500ul×1管
或HCV RT-PCR反应液（用于PE Gene Amp 7000/7700/7300，Bio-Rad iCycler等仪器） 1.5ml×1管
RT-PCR酶（带盖PCR反应管装） 24管
PCR Enhancer20ul×1管
DEPC水1ml×2管
对照品
阴性对照200ul×1管
强阳性对照（冻干粉）1管
定量标准品*）
定量标准品1（1.0－5.0×107IU/ml）100ul×1管
定量标准品2（1.0－5.0×106IU/ml）100ul×1管
定量标准品3（1.0－5.0×105IU/ml）100ul×1管
定量标准品4（1.0－5.0×104IU/ml）100ul×1管
*）定量标准品具体浓度请参照试剂盒内给定值。
储存条件及有效期
裂解液置4℃保存；
RT-PCR酶应为白色圆形颗粒，在室温条件下置于干燥器内保存；一旦潮解应弃用；
其他试剂－20℃保存，不宜反复冻融。使用前在室温下完全融化，并充分振荡混匀后稍事离心；
所有试剂避光保存；
所有试剂有效期为一年（请于有效期内使用）。
自备试剂
氯仿、异丙醇（－20℃预冷）、75％乙醇（用DNase、RNase Free水配制，－20℃预冷）
适用仪器
1. Corbett Research Rotorgene荧光PCR检测仪
2. Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪
3. PE Gene Amp 7000/7700/7300荧光PCR检测仪
4. Roche Lightcycler2.0荧光PCR检测仪
5. 其它多通道荧光PCR检测仪。
样本采集、存放及运输
1．样本采集：用无菌注射针头采5ml静脉血于不含有或含有EDTA作为抗凝剂的无菌离心管中，室温放置不应超过4hr，4hr内室温1,600g离心20min，分离血清或血浆转入无菌离心管中备用。
2．存放：分离后的血清或血浆标本在2℃—8℃条件下保存应不超过72hr；-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
3．运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。
使用方法
1．样本处理（样本处理区）
1.1. 试剂盒中强阳性对照为血清冻干粉，实验时先用100ul DEPC水复溶，混合均匀制成强阳性对照；取10ul强阳性对照加到剩余的DEPC水中，混合均匀制成临界阳性对照，然后按下述步骤与待测样本一起处理。
1.2. 取n个0.5ml的灭菌离心管，作好标记。
1.3. 在上述每一个管中各加入150ul裂解液和5ul内标RNA，然后分别加入待测样本和阴性对照、强阳性对照和制备的临界阳性对照各50ul，用吸头反复吸打混匀（一份样本换用一个吸头）；再加入50ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec或颠倒混匀15次（不宜过于强烈，以免产生乳化层）。
1.4. 离心（13000rpm，15min）。
1.5. 取与步骤1.2.中相同数量的0.5ml灭菌离心管，各加入100ul异丙醇和2ul Carrier RNA，作好标记。吸取步骤1.4.各管中的上层液相转移至相应的管中（注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质），颠倒混匀。
1.6. 离心（13000rpm，15min，注意固定离心管方向）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入300ul 75%乙醇，颠倒洗涤。
1.7. 离心（13000rpm，10min，注意固定离心管方向）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。
1.8. 离心（2000rpm，5sec，注意固定离心管方向），将管底部少量液体用微量加样器吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥1－5min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
1.9. 于干燥后的沉淀中加入20ul/15ul(根据使用50ul/25ul反应体系反应液)DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNase降解，请在2小时内进行逆转录）。
2．扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、PCR Enhancer，在室温下融化后，2,000rpm离心5sec。设所需要的PCR反应管数为n(n=样本数＋1管阴性对照＋1管强阳性对照＋1管临界阳性对照+4管定量标准品)，每个测试反应体系配制如下表：
反应体系荧光PCR检测仪 RT-PCR反应液 PCR Enhancer
50ul PE Gene Amp7000/7700/7300Bio-Rad iCycler等仪器 29.6ul 0.4ul
25ul RotorGeneRoche LightCycler2.0等仪器 9.8ul 0.2ul
计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，向其中加入n/2颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀后向各反应管中分装30ul/10ul(根据使用50ul/25ul反应体系反应液)，转移至样本处理区。
3．加样（样本处理区）
将样本处理步骤1.9.中20ul/15ul(根据使用50或25ul反应体系反应液)RNA溶液及定量标准品分别加入到上述反应管中，盖紧反应管管盖，转移到检测区。将反应管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
4．RT-PCR反应（检测区）
4.1.循环条件设置
使用Corbett Research Rotorgene荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:
42℃：30min；95℃：3min；
95℃：10sec,55℃：30sec,72℃；60sec，5个循环；
95℃：10sec，60℃：60sec，40个循环。反应体系为25ul。
定量标准品的浓度可在扩增之前设定也可在结果分析时设定。
使用PE Gene Amp 7000/7700/7300荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：
42℃：30min；95℃：1min；
95℃：10sec,55℃：20sec,72℃；30sec，5个循环；
95℃：5sec，60℃：30sec，40个循环。反应体系为50ul。
定量标准品的浓度可在扩增之前设定也可在结果分析时设定。
使用Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:
42℃：30min；95℃：1min；
95℃：10sec,55℃：20sec,72℃；30sec，5个循环；
95℃：5sec，60℃：30sec，42个循环。反应体系为50ul。
在扩增开始前样本设定时，将定量标准品设为“STND”并输入浓度值，待检样本和对照品设定为“UNKN”。
使用ROCHE LightCycler2.0荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:
42℃：30min；92℃：1min；
92℃：10sec,55℃：20sec,72℃；30sec，5个循环；
92℃：5sec，60℃：30sec，40个循环。反应体系为25ul。
在扩增开始前样本设定时，将定量标准品设为“STND”并输入浓度值，待检样本和对照品设定为“UNKN”。
4.2.仪器检测通道选择
使用Corbett Research Rotorgene荧光PCR检测仪时：
荧光素设定为Fam和Joe；荧光信号收集设在60℃。
使用PE Gene Amp 7000/7700/7300、Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪时：
荧光素设定为Fam和Vic/Hex；
使用Roche Lightcycler2.0荧光PCR检测仪时：
荧光信号收集设在60℃；
结果分析条件设定
1．使用Corbett Research Rotorgene荧光PCR检测仪进行结果分析时，基线可以在0－10个循环范围内根据噪音情况进行调整，阈值（threshold）可根据仪器噪音情况调整。外标阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且病毒滴度为0.0IU/ml为准；内标阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤30.0为准。
2．使用PE Gene Amp7000/7700/7300荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（baseline）的确定：取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值（threshold）可根据仪器噪音情况调整。外标阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且病毒滴度为0.0IU/ml为准；内标阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤30.0为准。
3．使用BIO-RAD iCycler进行结果分析时，基线取为2—10或2—15个循环的荧光信号，阈值可根据仪器噪音情况在15—40内调整。外标阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且病毒滴度为0.0IU/ml为准；内标阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤30.0为准。
4．在用PE7000/7700/7300/BIO-RAD iCycler进行分析的过程中，为避免漏检强阳性样本，应首先将基线定为6—10/3—10/6-10/2—10个循环的荧光信号观察分析Ct值，如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为6—15/3—15/6-10/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。
5．使用Roche LightCycler2.0进行结果分析时，分别用荧光记数值F1、F2读取内、外标结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且病毒滴度为0.0IU/ml为准，内标阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤30.0为准。或可根据仪器噪音情况进行调整；
质控标准
1．将定量标准品1—4的浓度值输入，仪器
