【PNAS】狼狈为奸！坏死性凋亡和细胞凋亡的有序激活介导缺血性脑卒中病理异常

缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。中国是全世界卒中发病率最高的国家之一，流行病学调查资料显示，我国每年约有2×106例新发脑卒中患者，现有脑卒中患者10×106例，其中约85%为缺血性卒中。因此，探究缺血性脑卒中的病理机制，意义重大。

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脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。

图片来源：Frontiers [1]

坏死性凋亡（Necroptosis），是不依赖于Caspase激活的一种细胞程序性死亡过程，其激活主要依赖于坏死性小体的形成。坏死性凋亡具有典型的坏死样形态：细胞膜被破坏，细胞、细胞器肿胀，乃至崩解；核内染色质无明显的形态改变。其次, 坏死性凋亡会引起的炎症反应，表现为大量的炎症细胞浸润和激活。

凋亡性坏死与细胞凋亡、焦亡的区别

图片来源：University of California, Berkeley

细胞凋亡（Apoptosis），是一种由基因控制的细胞程序性死亡过程。与细胞坏死不同，细胞凋亡是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。绝大多数细胞凋亡过程依赖于Caspase激活。

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过去研究表明，抑制caspase时细胞凋亡会转化为坏死性凋亡[2, 3]。然而，坏死性凋亡是否可转化为细胞凋亡及其转化条件，尚未可知。

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.03.03日，《美国科学院院刊》杂志刊登了哈佛大学医学院袁钧瑛研究组的最新重要工作[4]，他们揭示了缺血性损伤/再灌注条件下坏死性凋亡与细胞凋亡信号通路之间的相互作用关系及其分子机制，极大提高了人们在细胞程序性死亡领域的认知，为临床治疗缺血性脑卒中提供潜在的药物靶点。

袁筠瑛教授

图片来源：Agilent

结果

1.抑制RIPK1减少缺血性脑损伤

首先，为探究缺血再灌注诱发细胞死亡的分子机制，作者引入Ripk1激酶失活敲入小鼠Ripk1D138N/D138N与Ripk3基因敲除小鼠Ripk3-/-，并通过MCAO构建缺血再灌注模型展开研究。他们发现MCAO处理24小时（MCAO1小时，再灌注23小时）后，Ripk1D138N/D138N小鼠，而非Ripk3-/-小鼠，的病灶体积显着减小（图1A-B）。

在MCAO处理后，脑缺血区血管重新恢复血流灌注，会诱发病灶区内出现继发性脑出血现象，即出血性转化过程。为探究坏死性凋亡是否参与其中，作者再次引入上文两种小鼠，发现Ripk1D138N/D138N小鼠和Ripk3-/-小鼠出血性转化的发生率均显着下降，脑卒中引起的行为缺陷也有所缓解（图1C-D）。这些结果提示，坏死性凋亡介导了促进缺血性脑梗死的血管病变过程。此外，RIPK1可能更多地介导坏死性凋亡过程，因此抑制RIPK1活性比RIPK3缺失更具有神经保护性。

为探究RIPK1与RIPK3如何介导缺血性脑损伤，作者通过免疫印迹法检测RIPK1的激活水平。他们发现，缺血再灌注后1小时，RIPK1激活水平显着提高，此效应也存在于Ripk3-/-小鼠而非Ripk1D138N/D138N小鼠（图1E），表明在缺血性脑损伤过程中，RIPK1处于RIPK3的上游。他们还通过免疫染色方法探究发生RIPK1激活现象的细胞类型，发现缺血再灌注后2小时，小胶质细胞与内皮细胞中RIPK1激活水平最高；而缺血再灌注后2-5小时，神经元中RIPK1被显着激活，其激活水平在缺血再灌注后23小时达到峰值。其中，Ripk1D138N/D138N小鼠中RIPK1未被激活，Ripk3-/-小鼠中RIPK1的激活水平无明显差异（图1F-H）。

综上，缺血再灌注激活RIPK1以引起脑损伤，抑制RIPK1可减少病灶体积、降低脑出血发生率、缓解机体行为缺陷。而RIPK3缺失不影响RIPK1的激活，可降低脑出血发生率、缓解机体行为缺陷。

图1 抑制RIPK1减少缺血再灌注诱发的脑损伤

2.缺血性损伤激活坏死性凋亡与凋亡过程

由于缺血性损伤激活RIPK1，作者接下来就RIPK1介导的两条细胞死亡通路——坏死性凋亡与凋亡展开以下研究。在坏死性凋亡过程中，RIPK1与RIPK3相互作用以激活RIPK3，其标志物为p-T231/S232 RIPK3。激活的RIPK3与MLKL相互作用以激活MLKL，其标志物为p-S345 MLKL，进而介导坏死性凋亡的执行[3]。

作者发现，缺血再灌注小鼠脑中，RIPK3和MLKL被激活，标志着凋亡的caspase-3裂解带亦被检测到；而缺血非再灌注小鼠脑中，RIPK3未被激活（图2A-C）。他们还使用免疫染色方法，发现缺血再灌注后，小鼠皮层缺血半影区内p-T231/S232 RIPK3和p-S345 MLKL与CD31+内皮细胞共免疫染色（图2D-E）。他们还发现，缺血再灌注后神经元中p-T231/S232 RIPK3和p-S345 MLKL含量显着增加，裂解的caspase-3+亦有上调（图2F-H）。此外，在Ripk1D138N/D138N小鼠和Ripk3-/-小鼠中，缺血性处理未上调p-T231/S232 RIPK3和p-S345 MLKL；裂解的caspase-3+在Ripk1D138N/D138N小鼠中上调，而在Ripk3-/-小鼠中未上调（图2F-H）。

综上，缺血再灌注会引起内皮细胞坏死性凋亡，导致脑出血现象。缺血再灌注既引起神经元坏死性凋亡，也引起神经元凋亡。

图2 缺血性损伤激活坏死性凋亡与凋亡过程

研究表明，卒中会引起炎症，坏死性凋亡与凋亡均可促进炎症[5]。接下来，作者研究RIPK1与RIPK3在促炎过程中的功能。他们使用RT-PCR方法，以检测小鼠促炎性细胞因子和趋化因子的转录水平。他们发现，缺血再灌注后，Ripk1D138N/D138N小鼠脑内TNFα、IL6、IL1α、IL1β和Cxc11的转录水平均显着下调，而Ripk3-/-小鼠脑内上述促炎性细胞因子和趋化因子的转录水平与野生型小鼠相仿，在缺血性处理后23小时部分因子下调（图3），提示RIPK1介导的炎症反应在缺血再灌注后早期被激活，而RIPK3介导的坏死性凋亡会在缺血再灌注后晚期参与炎症反应。

图3 抑制RIPK1阻断缺血再灌注诱发的炎症反应

3.缺血性损伤引起TAK1含量下调

然后，作者探究缺血再灌注促进细胞凋亡的机制。研究表明，TAK1是细胞凋亡的重要负性调节因子[6]。为探究TAK1是否参与缺血再灌注引起的细胞凋亡过程，作者引入MCAO小鼠模型，发现缺血再灌注处理2小时后，Ripk1D138N/D138N、Ripk3-/-及野生型小鼠脑内TAK1含量均显着下调，TAK1下游底物的磷酸化水平亦显着降低（图4A-B），提示TAK1的缺失与RIPK1、RIPK3无关，且TAK1可能是RIPK1、RIPK3的上游分子。他们还引入免疫染色实验，发现TAK1存在于小胶质细胞和神经元中，缺血再灌注23小时后 这两种细胞中TAK1含量显着下调，且TAK1与裂解的caspase-3+几乎无共标（图4C-E）。

为进一步探究下调的TAK1含量是否由血流灌注不足引起，作者去除原代培养神经元和小胶质细胞培养基中的血清，发现两种细胞中TAK1含量下调（图4F-G），同时抑制蛋白酶体和溶酶体降解过程会阻断上述过程，而只抑制其中之一并不会（图4H-I）。他们还在缺血性处理中血流量减少＜80%（血流量减少但不引起卒中）的脑区中发现，TAK1含量下调（图4J），表明血流灌注不足可充分引起细胞中TAK1含量下调。

图4 缺血性损伤引起TAK1含量下调

4.下调TAK1促进缺血性损伤引起的细胞凋亡过程

再然后，为探究卒中脑中TAK1下调的功能性意义，作者引入下调髓细胞或神经元中TAK1表达水平的转基因小鼠MAP3K7fl/fl;Lyz2cre/+和MAP3K7fl/fl;Emxcre/+。他们发现，缺血性损伤后两种小鼠的病灶体积都显着增加，RIPK1均被激活，且MAP3K7fl/fl;Emxcre/+小鼠RIPK1激活时间更久（图5A-B）。借助免疫荧光手段，他们还发现缺血再灌注5小时后，MAP3K7fl/fl;Lyz2cre/+小鼠的小胶质细胞与神经元中RIPK1被显着激活；缺血再灌注4天后，MAP3K7fl/fl;Emxcre/+小鼠的神经元中RIPK1被显着激活（图5C-E），表明TAK1缺失促进了小胶质细胞及神经元中RIPK1的激活过程。

图5 下调TAK1促进RIPK1的激活过程

最后，作者探究TAK1缺失与细胞凋亡之间的关系。他们发现，缺血再灌注2小时后，MAP3K7fl/fl;Lyz2cre/+小鼠中裂解的caspase3的含量上调，早于野生型小鼠；而MAP3K7fl/fl; Emxcre/+小鼠中裂解caspase3的上调时间与野生型小鼠相仿，但上调幅度更大，持续时间更长（图6A-B），表明凋亡通路被激活。此外，缺血再灌注后，两种小鼠脑中的促炎性细胞因子和趋化因子的含量也显着上调（图6C），表明凋亡的激活促进炎性因子释放。

为进一步探究上述凋亡激活过程是否依赖于RIPK1激酶功能，作者施加RIPK1激酶的抑制剂。他们发现缺血性损伤后，两种转基因小鼠脑中裂解caspase3水平不再上调（图6D-E）。

综上，下调TAK1后，缺血性损伤促进RIPK1激活过程，进而促进细胞凋亡过程。

图6 下调TAK1促进缺血性损伤引起的细胞凋亡过程

总结

坏死性凋亡与细胞凋亡是两种细胞程序性死亡过程，但究其二者之间的相互作用关系，我们知之甚少。本篇文章结合脑卒中模型构建、蛋白质印迹、免疫荧光、转基因小鼠等方法，发现缺血性损伤/再灌注早期激活内皮细胞中RIPK1以驱动坏死性凋亡过程，以诱发脑出血现象与促炎反应，RIPK3缺失可延缓上述过程。他们还发现，血流灌注不足会下调细胞内RIPK1抑制因子TAK1的含量，进而促进坏死性凋亡过程向细胞凋亡过程转化。此外，条件敲除TAK1促进缺血性损伤引起的细胞凋亡过程。这项研究阐释了缺血性损伤/再灌注诱发的坏死性凋亡与细胞凋亡之间的相互作用关系及其分子机制，为临床治疗缺血性脑卒中提供潜在的药物靶点！

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参考文献

1. Alawieh, A., A. Elvington, and S. Tomlinson,Complement in the Homeostatic and Ischemic Brain.Frontiers in Immunology, .6(417).2. Degterev, A., et al.,Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury.Nature Chemical Biology, .1(2): p. 112-119.3. Wallach, D., et al.,Programmed necrosis in inflammation: Toward identification of the effector molecules.Science, .352(6281): p. aaf2154.4. Naito, M.G., et al.,Sequential activation of necroptosis and apoptosis cooperates to mediate vascular and neural pathology in stroke.Proceedings of the National Academy of Sciences, .117(9): p. 4959.5. Yuan, J., P. Amin, and D. Ofengeim,Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases.Nature Reviews Neuroscience, .20(1): p. 19-33.6. Geng, J., et al.,Regulation of RIPK1 activation by TAK1-mediated phosphorylation dictates apoptosis and necroptosis.Nature Communications, .8(1): p. 359.