环状RNA（circRNAs）是一种特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。近年来RNA测序快速发展，已发现有数千种circRNAs 在哺乳动物组织中广泛表达，尤其是疾病状态下circRNAs的表达特点更是得到广泛关注。本期CNS说主要介绍circRNAs生物发生和生物学功能上的最新进展，并对其在心血管系统的研究前景进行展望。
circRNAs最早发现于1970年代，但是长期以来一直被认为是RNA的错误剪接产物，近年来测序技术迅猛发展，既往理论不断得到推翻。到目前为止，人类组织中已经检测到了30000多种不同的circRNAs。这种特殊的非编码RNA产生于前体RNA（precursormRNA, pre-mRNA）的剪接过程，多数情况下是由1-2个外显子的反向剪接形成，封闭环状结构使其不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。近年来研究发现部分circRNAs分子富含microRNA（miRNA）结合位点，能够发挥miRNA海绵（miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。一炒即火的机制，近年来也受到了挑战，circRNAs的奥秘，远不止于此。
环状RNA的基本特征
circRNAs是线性转录本的异质家族，环化方式分为内含子环化和外显子环化，目前主流的成环机制有依赖于剪切体的索尾插接环化、依赖顺式作用元件的环化以及RNA结合蛋白（RBPs）调控的环化。
Fig.1 Schematic representationshowing the three mechanisms for circular RNA biogenesis.
circRNAs在结构上，可以只含外显子、只含内含子或二者都有；大小上，一百到几千个核苷酸不等；来源上，蛋白编码转录本或者LncRNAs等非编码转录本，都可；表达上，①组织差异性明显，人脑中20%的基因能够产生circRNAs，而心脏中小于9%，癌细胞等增殖细胞circRNAs水平要远低于终末分化细胞。②环状/线性比例差异明显，由于反向剪接的效率较低，多数circRNAs的表达水平只占其线性转录本的5-10%，但由于不受核酸外切酶影响，部分circRNAs可以积累到很高的水平，已发现有几十种circRNAs的表达水平要高于相应的线性转录本（发现一种就很赚啦）。③circRNAs的表达随着发育、疾病进展存在动态变化，发育或衰老引起表达改变的原因可能是circRNAs的生成增多、稳定性增加，或者细胞增殖能力减弱，对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行β肾上腺素刺激，模拟慢性或急性应激状态，可见多种circRNAs的表达情况出现动态变化，类似地，氧化应激或者高温也会影响circRNAs的表达。
circRNAs的研究方法
Fig.2 Computational strategies for circular RNAdetection
①生信分析：依赖于RNA测序技术和生物信息学的发展，circRNAs研究在过去的５年内突飞猛进，形成了多种专门用于circRNAs研究的计算程序和工具，最近又涌出一种以短序列（k-mers）分析为特点、不依赖于参考基因组片段比对的算法，片段信息完整性更高。不同预测工具的鉴定策略不同，相应地，检测到的circRNAs类型、准确度和敏感性也有所不同。因此，实际应用时，应根据研究需要，选择最合适、更全面的预测工具。②实验验证circRNAs表达：最常用方法是RT-PCR，关键步骤是设计能够扩增反向剪接结合区的发散性引物，之后通过Sanger测序验证反向剪接位点的存在，核糖核酸外切酶R处理、多聚A尾RNA筛选实验进一步证实环化的形成。③circRNA的沉默和过表达：小干扰RNA（siRNAs）或者短发夹RNAs是常用的circRNAs沉默方法。第二种方法是CRISPR–Cas9策略沉默circRNAs的表达，但现技术敲除反向剪接外显子的同时，也会影响线性转录本的表达，未来策略可以针对circRNAs生成所必需的特定内含子序列进行突变或者敲除。过表达circRNAs的方法主要是插入促表达互补序列、构建目标circRNAs的扩增载体，例如果蝇的laccase2基因（stw）或者人工设计的序列。
Fig.3 Experimental approaches to detect andmanipulate circular RNAs
circRNAs的生物功能
circRNAs的生物学功能及其作用机制一直是最为关注的问题。目前circRNAs研究中最重大的的生物学功能发现是circCdr1as对miR-7的分子海绵作用，缺乏circRNA Cdr1as（Circ7）的小鼠会出现神经系统紊乱。但值得一提的是，只有circRNA的表达丰度与相应miRNA类似时，分子海绵的效用才能发生，但大多数circRNAs表达丰度很低，且circRNAs的生信分析并未发现miRNA结合位点的富集，因此分子海绵似乎并不是circRNAs在生物体内的主要作用机制。除此之外，circRNAs还有蛋白作用支架、调节基因转录、蛋白合成模板（circRNAs也许可以通过内部核糖体进入位点（IRES）进行翻译）等功能。
Fig.4 Mechanismsof circular RNA functions
心脏中的circRNAs表达情况，在小鼠心脏中鉴定出了575种circRNAs，人心脏中7000-16000种circRNAs，高丰度表达的circRNAs保守性可达19%。人心脏中表达丰度最高的circRNA是circSLC8A1，它与编码钠钙交换体1（NCX1）的SLC8A1基因同源，单一外显子，进化上保守，表达水平是线性mRNA SLC8A1的40倍。人心脏中，编码肌联蛋白titin的TTN基因的同源circRNAs亚型最多，具体亚型数目还未统一，这些circRNAs大多数都源自基因中编码分子弹簧部分的I带，直接影响到肌节和整个心脏的弹性，该带也是可变剪接密集区，RBM20是调控I带可变剪接的主要剪接因子，RBM20变异后会产生强顺应性的大肌联蛋白亚型，与临床上扩张性心肌病的发生高度相关。有趣的是，RBM20对其中一簇circRNAs的形成有重要的调节作用，有望证明，RBM20突变引起心肌病的原因并不局限于线性转录本的剪接异常，可能还包括相应circRNAs的生成异常。
circRNAs在心血管系统中的功能研究目前在心血管领域对于circRNA的功能研究较少，第一项有关心脏中circRNA功能的研究发表于，该circRNA源于PWWP2A基因的circRNA，被称为心脏相关的circRNA(heart-related circRNA,HRCR)，能够作为miR-223海绵抑制心肌肥大和心衰。HRCR包含六个miR-233结合位点，拉下实验（pull-down assay）显示miR-223可以直接与HRCR 结合；在培养的心肌细胞中敲减HRCR后，miR-223的内源性靶点表达降低；对异丙肾上腺素处理的小鼠静脉输送HRCR腺病毒可以缓解心肌肥厚状态、改善心功能。这些结果表明，小鼠心衰时HRCR表达水平下降，纠正HRCR紊乱可能是心衰治疗的潜在方向。另一种circRNA来源于Foxo3基因，在衰老的人和小鼠心脏中的表达显著高于年轻状态，在培养的成纤维细胞中异常表达circFoxo3可以促进细胞衰老。另外，活体中过表达circFoxo3会加重阿霉素诱导的心肌病，而沉默内源性的circFoxo3则会得到缓解。机制上，circFoxo3可以与DNA结合蛋白抑制剂ID1、转录因子E2F1、局部黏着斑激酶1（FAK1）以及缺氧诱导因子1α相互作用，使得这些衰老相关的蛋白出核重新在胞质中定位。该团队还发现了一种来源于cAmotl1基因的circAmotl1，体外实验过表达circAmotl1可以提高心肌细胞的存活、减少凋亡，而沉默该circRNA则是相反的结果。在阿霉素诱导心肌病的小鼠模型中，过表达circAmotl1可以改善左心室扩张、减少胶原沉积、抑制凋亡，起到心脏保护作用。机制上，circAmotl1可以促进蛋白激酶B(AKT) 的激活，从而激活下游的核转位。一种来源于Myo9A转录本的circRNA(circRNA_000203)在糖尿病小鼠心脏中表达明显上调，功能上，circRNA_000203能够发挥miR-26b-5p海绵的作用，从而增加Col1a2、Col1a3 和Acta2的表达，这种circRNA可能是一种治疗心肌纤维化的重要靶点。circRNAs表达稳定，有望成为人类某些疾病的血液标志物，例如冠状动脉疾病保护性单倍型携带者相对于非携带者，外周血单核细胞以及全血中circANRIL的表达含量显著增加；急性心梗患者再通时血液样本中心梗相关circRNA(myocardial infarction-associated circRNA,MICRA)的表达水平与4月后是否存在左心室功能不全（射血分数≤40%）密切相关；源于L型钙通道α1亚基转录本的hsa_circRNA_025016，有望成为术后房颤预测的血浆标志物。
Tab.1 Circular RNAs with a function in the heart
总结与展望近五年对circRNAs的研究日渐火热，确实阐述了部分circRNAs的重要功能，但仍有上千种circRNAs的功能尚不明确，尤其是在体功能研究，针对circRNAs的CRISPR–Cas9、siRNA等表达干扰技术亟待完善。总体来说，目前对circRNAs在心血管系统中的功能和机制研究很少。现总结两个较为有趣的研究思路：1.现已证明circRNAs在胞外囊泡中有表达，因此，通过采集组织特异性和疾病特异性的囊泡，进行circRNAs分析，相比全血circRNAs检测，能够更好地表征疾病起始、严重性以及进展等信息，是一种非常有前景、有价值的研究手段；2.考虑到circRNAs的高度稳定性，它们可以作为特定细胞功能的长时程调解因子，因此通过基因工程构建过表达circRNAs载体，结合miRNA或者RBP发挥调节作用，也可引入IRES序列促进蛋白过表达，在分子医学治疗领域很有前景。
[1] AUFIERO S, RECKMAN Y J, PINTO Y M, et al.Circular RNAs open a new chapter in cardiovascular biology [J]. Nature reviewsCardiology, , 16(8): 503-14.
