来源：探肝
在全球范围内，肝细胞癌（HCC）的癌症死亡率排第三。HBV病毒感染是导致发病的重要因素，尤其是在东亚地区。虽然早期手术治疗较为有效，但五年生存率仅50%-70%。利用蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学，研究人员分析110例由HBV感染引起HCC的早期样本。蛋白定量结果展示了早期HCC存在异质性。研究人员将队列划分为三种亚型：S-I，S-II，S-III，不同亚型临床效果不同。S-III亚型中胆固醇不平衡，经一线手术后，预后最差、生存周期最短。SOAT1高表达是S-III亚型的特有特征，敲除SOAT1后，改变了细胞胆固醇分布，有效抑制了HCC的扩散与转移。最后，基于HCC人源肿瘤移植小鼠模型，研究人员发现使用SOAT1抑制剂阿伐麦布（avasimibe）进行治疗，高SOAT1表达水平样本的肿瘤体积明显缩小。本研究利用蛋白质组学对早期HCC分类，深入研究了HCC的肿瘤生物学，并为个性化治疗提供可能性。
文章信息
文章题目：Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma
杂志名称：Nature
发表日期：.02
样本和研究方法
蛋白质组学：110例早期原发HCC肿瘤样本及配对正常肝组织
WGS：93例肿瘤及正常对照
RNA-seq：35例新鲜配对肿瘤及正常对照
研究结果
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蛋白质表达及功能
经蛋白质组学分析，从101个肿瘤样本、98个正常样本中鉴定到9,142个基因的9,252个蛋白质产物，从103个肿瘤样本及配对样本中鉴定到5,847个蛋白的27,651个磷酸化位点。WGS鉴定到6,863个基因上的11,733非沉默突变及8,986沉默突变。RNA-seq得到16,457个编码基因的信息。肿瘤样本鉴定到的蛋白质数目明显多于配对的正常对照（图1）。其中，肿瘤样本平均鉴定到5,953个蛋白，正常对照平均鉴定到5,114个蛋白。此外，在肿瘤样本中，高甲胎蛋白（高AFP；AFP > 200ng/ml）、微血管浸润阳性（MVI+）患者相比于低AFP和MVI-的患者鉴定到更多的蛋白质，这一结果也被RNA-seq数据所支持（图S3c-e）。
图1 HBV相关早期HCC的蛋白鉴定情况
图S3 HBV相关早期HCC基因表达情况
早期HCC患者上调蛋白的信号通路富集于细胞循环、整合素、PDGF信号通路、MAPK、TNF、MET等。下调蛋白的信号通路富集于PPAR及代谢相关通路。另外，磷酸化蛋白质组学数据展示了HCC信号通路中的过度磷酸化（包括p38通路，RHO调控通路，肌球蛋白通路，RB1通路及IL1信号通路），表明在HCC炎症及转移中磷酸化非常活跃。
高AFP HCC样本展现出免疫相关通路（TCR，CXCR4，NFκB和FCγR介导吞噬作用）上调，以及细胞黏附分子、Rho GTPase信号和FAK途径上调。MVI阳性HCC患者上调蛋白富集于细胞外基质-受体互作及TGF-β信号通路。高AFP或MVI HCC患者中，大多数高度磷酸化蛋白与细胞黏附、细胞循环、转录调控相关。这些结果展示早期HCC的分子多样性。为了阐明抑癌基因突变的作用，研究人员发现25%的p53突变及超过50%的其他抑癌基因突变，通过蛋白质截断突变、移码突变或异常剪接，最终导致功能失活。尤其是TSC1和TSC2分别存在71%和100%的功能失活突变。由于TSC1和TSC2突变影响mTOR的活性，研究人员观察mTOR下游底物，发现在有TSC1和TSC2突变的HCC中，RPS6在pS236，pS240和pS244位点存在过度磷酸化。在以往研究中，WNT信号通路中原癌基因蛋白CTNNB1的31-45氨基酸区域发现了激活的突变热点。由激活突变导致的β-连环蛋白异常核异位能够引起肝脏相关WNT靶基因转录。与以上结果一致的是，研究人员发现GLUL和CYP1A2在CTNNB1激活突变的肿瘤中显著上调，表明CTNNB1激活突变可能引起这些基因上调，从而促进肿瘤细胞生长、增殖。
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分子分型及预后研究
蛋白质组学主成分分析能够很好区分肿瘤及正常样本，同样也展示了肿瘤样本间的高度异质性（图S5a）。采用非负矩阵因式分解一致性聚类分析，研究人员确定了与HBV感染相关的早期HCC肿瘤队列中的三个主要蛋白质组亚型（图2a），S-I、S-II、S-III分别包含36、32和33例样本。临床特征显示S-III亚型患者MVI+、高AFP程度更高，年纪更小（图2b）。相对S-I或S-II，S-III亚型患者生存率更低，术后死亡率更高（图2c）。这一结果被额外的HCC队列所证实。此外，S-III亚型患者复发概率更高。这些结果提示S-III型肿瘤与预后不良有关。大量与三种亚型特异性预后相关的蛋白被鉴定，其中许多HCC新的预后相关蛋白如SLC3A2，PRPF4和SOAT1在mRNA和蛋白丰度水平显示出中等或低的一致性。
图S5 样本PCA分析
图2 HBV相关早期HCC患者的蛋白组学分型及临床特征
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分子分型与功能富集
结合1,269个蛋白及466个蛋白中的662个磷酸化位点进行有监督分析，揭示了不同亚型的特征。根据这些特征，富集分析得到34个核心通路。S-I亚型中，肝脏功能相关蛋白（如CYP1A2，CYP3A4和OTC）和通路（如解毒、尿素循环）特异性上调，展示这类肿瘤的肝样特征。S-II和S-III亚型均表现为高水平增殖蛋白（如CDK1，HDAC2，PCNA，PRPF4和THOC6）和通路（如HDAC，MYC，E2F和细胞循环），展示这类肿瘤的增殖特性。相较S-I和S-II，S-III亚型更具侵袭性，包括不良预后相关蛋白（如TGFβ1，KRT19和MMP9）上调及促肿瘤通路（如TGFβ，HIF1）激活（图3a）。侵袭性亚型HCC转录特征包括Hoshida S1，TGFβ激活，细胞增殖，Hippo沉默等，进一步支持了侵袭特征。相比之下，低侵袭亚型分子特征（Hoshida S3，WNT和CTNNB1激活）更多出现在S-I和S-II亚型患者中，均携带CTNNB1突变。
S-III亚型另一个有意思的特征是较高水平的免疫浸润。研究发现特异性免疫浸润特征在S-III肿瘤中显著富集，这一现象得到病理染色的证实。此外，30例S-III中的18例“免疫”样本特异性富集于T耗竭，M2巨噬细胞和免疫调节性T细胞，说明S-III亚型中存在抑制免疫类型。同样的，许多这类免疫细胞标志物（如PD1，CTLA4，TGFβ1，TLR2和CSF1R）在S-III样本中显著上调。代谢紊乱也是S-III亚型的一个特征，这一类型包括糖酵解和酒精代谢途径中蛋白质改变（图3a）。
S-III亚型HCC患者术后预后较差，需进一步靶向治疗：有针对这一亚型特异特征的FDA批准的蛋白靶向药物和正在进行临床试验阶段的候选药物（图3b）。然而，大量已知治疗靶点，如TGFβ1，HDAC2，CDK1和MMP9，在HCC患者中展示出高死亡风险。其中，催化脂肪酸胆固醇酯形成的SOAT1预后风险得分最高，作为药物靶点，未来可能在临床治疗中获益（图3b）。101例患者中，肿瘤样本的SOAT1丰度明显高于癌旁组织（图3b）。与蛋白质组学分析结果一致，组织样本芯片数据（TMA）同样表明SOAT1在254个HCC患者中上调。伴随SOAT1高表达，三个常见胆固醇（胆固醇18:1，16:0和20:2）在22例HCC肿瘤样本中表达均高于正常对照样本。除了SOAT1，其他6个与胆固醇平衡相关的关键蛋白，包括LDLR（吸收）、NPC1（运输）、SCAP和SREBF2（调控）、HMGCR（合成）、CYP7A1（分解代谢），同样在HCC肿瘤样本中显著上调，说明HCC患者中胆固醇平衡发生改变。
图3 S-III亚型肿瘤的蛋白、通路特征及HBV相关早期HCC对应的靶向药物
此外，蛋白质组研究队列、TMA队列及TCGA数据库队列均展示SOAT1表达水平与生存周期显著相关（图4a）。对三个队列HCC患者进行单因素、多因素比例风险回归（COX）分析，表明SOAT1丰度的提升是导致不良预后独立且显著的因素。此外，人类病理学数据库表明，多癌种中SOAT1上调与生存周期显著相关。此前也有研究报道过在前列腺癌与胰腺癌中，高SOAT1丰度与不良预后相关。以上结果强烈表明高表达SOAT1是多种肿瘤的共同特征，未来可用作多肿瘤诊断标记物或治疗靶点。
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SOAT1功能验证
为了验证SOAT1在HCC中的角色，研究人员敲除了HCC细胞系（PLC/PRF/2和HepG2）中的SOAT1基因，得到低SOAT1丰度的样本，发现细胞系的增殖和转移得到显著抑制（图4b-c）。并观察到这与SOAT1抑制剂阿伐麦布（avasimibe）治疗有着相似的效果（图4d-e）。对PLC/PRF/5 SOAT1敲除或采用avasimibe治疗的样本进行蛋白质组学分析，表明大量受体位于细胞质膜，这对肿瘤生长和转移至关重要，如ITGAV，ITGAL，ITGA6，ITGB4和TGFβR1，均显著下调。一些位于细胞质膜的受体，如整合素，受细胞质胆固醇水平的调控。正如期望的，SOAT1敲除和avasimibe治疗降低了肿瘤细胞质膜胆固醇水平（图4f），同时细胞内胆固醇运输相关蛋白（SREBF2，LDLR，RAB8A和MYO5B）下调。免疫印迹分析证实了这些关键蛋白表达上的变化（图4g）。综上，SOAT1下调通过减少细胞质膜胆固醇水平，抑制整合素和TGFβ信号通路，最终抑制HCC细胞增殖和转移。对HCC人源肿瘤移植（PDX）小鼠模型腹腔内注释avasimibe，每天15mg/kg。治疗四周后，PDX模型体重无变化，对低SOAT1 PDX模型无显著影响（图4h）。而高SOAT1 PDX模型的肿瘤体积显著减小（图4h），表明avasimibe对高SOAT1表达样本存在治疗效果。比较高SOAT1和低SOAT1 PDX模型S-III亚型相关代谢通路蛋白，高SOAT1 PDX模型重现了HCC S-III亚型的分子特征。因此SOAT1可作为有效的诊断标记物和潜在治疗靶点，用于改善HCC S-III亚型的不良预后。
图4 高SOAT1表达水平与HCC不良预后相关，将促进肿瘤生长、转移
总 结
本次研究鉴定了早期HCC的蛋白质图谱及不同蛋白质亚型的蛋白质特征、通路情况。蛋白质组学层面鉴定到的药物靶点可能为鉴定不良预后HCC患者提供有力工具，这些患者可以受益于靶向治疗。
参考文献
Ying Jiang,et al. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature()
