乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒
【生产厂家】深圳益生堂生物企业有限公司
【批准文号】国药准字S0086
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】40人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【药品名称】
乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒
【英文或拉丁名】
DNA microarray kit for the HBV genome and YMDD aberrance
【汉语拼音】Yixingganyan bingdu hesuan ji YMDD bianyi jiance shijihe
【主要成分】1. 微阵列玻片 10矩阵 5片 2. HBV阳性对照血样60ul
3. HBV阴性对照血样60ul 4. PCR反应液1.4ml
5. 酶混合物 25ul 6. 样品处理液 1.5ml
7. 杂交反应液A 100ul 8. 杂交反应液B 800ul
9. 洗涤母液A25ml 10.洗涤母液B10ml
微阵列玻片外观及点样矩阵示意图说明如下：
注：红色点为HBV DNA 检测探针，黑色点为阴性探针，兰色点为YMDD变异检测探针
乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒微阵列玻片第4矩阵YMDD变异检测探针分布表如下（其余矩阵与此相同）：
528-1
528-3
552-1
552-3
555-1
555-3
555-D
A
atg（M）
cta（L）
atg（M）
ata（I）
atg（M）
gta（V）
ata（I）
G
gtg（V）
ctg（L）
gtg（V）
atg（M）
gtg（V）
gtg（V）
atg（M）
C
ctg（L）
ctc（L）
ctg（L）
atc（I）
ctg（L）
gtc（V）
atc（I）
T
ttg（L）
ctt（L）
ttg（L）
att（I）
ttg（L）
gtt（V）
att（I）注：红色为突变热点，黄色为常见野生型，兰色为未见报道序列，未加本底色者为少见序列。
【使用目的】
本品适用于乙型肝炎病毒核酸及乙型肝炎病毒YMDD变异的体外检测。
【试验原理】
乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒使用了PCR、微阵列玻片二项技术，用于检测HBV DNA及DNA多聚酶区L528M、M552I、M552V、及V555I、L555I、M555I突变。
微阵列玻片共使用30条寡核苷酸探针，其中28条探针用于YMDD变异检测，1条探针位于HBV DNA多聚酶保守区，用于HBV DNA的检测，另一条探针为阴性探针，该探针与HBV DNA检测探针碱基组成完全一样，只是排列顺序不同。
使用时，常规采集的血清/血浆标本经简单处理，释放出HBV DNA，HBV DNA通过PCR进行扩增，同时带上荧光标记，扩增产物经变性后与固定于微阵列玻片不同位置的一系列探针杂交，杂交结果经扫描仪扫描得到扫描图像，经软件分析处理后得到检测结果。
【适用仪器】
1． 离心机
2． PCR仪
3． 荧光扫描仪
4． 普通水浴锅、烧杯、杂交盒等常用仪器器皿
【样本要求】
新鲜或-20℃以下保存的血清或血浆(枸橼酸钠抗凝)。
【试验方法】
1．样品处理及PCR扩增反应:
1.1取待检血清或试剂盒阴阳性对照15μl，加入至已加有30μl样品裂解液的离心管中，混匀，沸水浴处理10分钟，12000rpm离心10分钟；
1.2取一支灭菌离心管，配制PCR反应混合物（27.5ul PCR反应液×反应管数+0.5ul酶混合物×反应管数），混匀(按上述方法配制的PCR反应混合物通常会不够用,建议计算时将反应管数加1)；
1.3取出PCR反应管，标号，分别加入28μl PCR反应混合物至各管中；
1.4小心吸取2μl处理标本上清液至PCR反应管中，混匀，8000rpm离心数秒，37℃处理10 min，然后按下列参数进行PCR反应:
2.杂交检测
2.1取出微阵列玻片包装盒，室温平衡15分钟；
2.2取出微阵列玻片，在磨砂部位作好标记，将其平放在实验台上，同时将试剂盒所带杂交反应液、洗脱母液A、B置50℃水浴5分钟，摇匀；
2.3取出2ul PCR产物，与2ul杂交反应液A混合，室温放置5分钟，加入16ul杂交反应液B，混匀，离心数秒；
2.4立即取10μl杂交混合物加于微阵列玻片反应区中，使其分布均匀，将微阵列玻片平置于湿盒或杂交盒中，于50℃水浴中杂交1小时；（杂交反应时应防止冷凝水滴落在微阵列玻片上）。
2.5在杂交反应过程中，按下述配方配制洗涤液A、B、C，
洗涤液A: 10ml洗涤母液A与186ml蒸馏水混匀后加入4ml洗涤母液B;
洗涤液B: 1ml洗涤母液A用蒸馏水稀释至100ml;
洗涤液C: 0.5ml洗涤母液A用蒸馏水稀释至100ml;
2.6将洗涤液A、B、C分别倒入四个100ml烧杯中，每个烧杯80ml，其中洗涤液A两个烧杯（标号为洗涤液1，洗涤液2），洗涤液B与洗涤液C各一个烧杯（分别标号为洗涤液3和洗涤液4），；
2.7杂交反应结束后，将微阵列玻片连同杂交物置于洗涤液1中，漂洗数秒，去掉覆膜，然后依次置于洗涤液2、3、4中各1分钟，其间不断搅动。取出，甩去残留在微阵列玻片上的液体，室温晾干（洗涤过程应连续进行，避免微阵列玻片干燥）。
3.扫描分析
3.1将晾干之玻片用GenePix4000B扫描仪扫描，PMT与激光强度设置分别设定为600与10，激发波长为532nm；
3.2扫描图象用扫描仪自带的图象分析软件或Imagene等专用图像分析软件对扫描结果进行定量分析，并保存分析结果。
3.3利用“乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒”结果分析软件HBV Pro2.1（此软件由本公司另行免费提供，请向本公司业务人员索取）进行结果分析与整理。使用时双击HBV Pro2.1分析软件图标，点击Select File”按钮，选择保存的图像分析结果文件名，然后点击“Start Analysis”按钮，分析软件自动进行结果分析。在生成的检测报告单的相应位置填写相关的基本信息，保存分析结果。
3.4打印检测报告单。
【试验结果的解释】
1. 依据乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒检测结果报告单进行结果判定。报告单包括HBV DNA与多聚酶基因528位、552位、555位密码子检测结果，可根据报告单判断相应检测结果；
2. 当乙型肝炎病毒核酸及YMDD变异检测试剂盒检测结果报告单显示为“实验失败，请重做”时，应分析试验失败的原因，并重复检测一次，再次重做失败时请与公司市场支持人员联系。
【注意事项】
1. 试剂盒从冰箱中取出后，应平衡至室温方可使用。
2. 每种液体试剂使用前均应混匀，杂交反应液、洗脱母液A、B用前置50℃助溶至澄清。
3. PCR反应液、阴阳性对照、样品处理液、酶混合物应于-20℃贮存，其它试剂开盒后均应置于室温下保存，保存时间不超过一个月。
4. PCR反应液中有荧光标记物，请注意避光保存。
5. 加样时注意使液体铺满整个反应区，但不能溢出，以防交叉污染。
6. PCR产物若不马上进行杂交检测，请置－20℃冰箱保存，但不应超过1周。
7. 洗片过程中，要避免洗液接触手或记号笔的痕迹，以防止其它荧光物质的污染。
8. 洗片完成前应避免玻片晾干。
9. 稀释后的80ml洗涤液可用于4张玻片的洗涤。
10. 试剂盒应按含有传染性材料对待。
11. 按说明书要求严格操作。
【包装及规格】
40人份/套，每套由A盒和B盒组成。
【贮藏】
A盒2-8℃保存，B盒于-20℃避光保存
【有效期】
12个月
