摘要
介绍
仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产重组治疗蛋白的首选宿主细胞。的确,排名前十的生物制品出自CHO宿主细胞,因为他们提供了优于其他哺乳动物细胞产生蛋白质药物的性能,如近似于人体的翻译后修饰,高效的转基因放大系统,易于适应悬浮培养和组分确定的化学培养基以及广泛的药物批准记录。CHO细胞的这些非凡的记录是过去20-30年里，生物学进程每一个环节进步的合集，宿主细胞系工程化、细胞株选择/筛选和细胞培养基设计等生物过程开发的多个步骤都取得了长足进步。
生物制药生产工艺的持续改进主要分为两大阶段:细胞系开发与工程化(CLD&E)和培养工艺开发，其中重点关注开发成本效益，和获得高产表达宿主以增加利润。在细胞培养工艺方面，CHO细胞培养和培养基组成方面已取得重大进步，可以实现细胞快速生长，并在较长时间内保持高活细胞密度(VCD)。另外，CLD&E从治疗性蛋白的高表达到其在细胞外的持续分泌等方面使CHO宿主细胞性能在不同水平上也有了提高。此外，CHO细胞也被设计成满足特定产品表达需求的宿主，包括精确地翻译后修饰，治疗蛋白中的N-糖基化以及降低/消除序列变异的治疗蛋白。近年来。细胞工程主要致力于开发储蓄型灌流生产中高效稳定表达的细胞株开发。
在这篇综述中，我们首先总结了CHO 细胞CLD&E的历史，然后我们详细描述了在CHO细胞系工程化和应用过程中相关技术的进步。最后，我们提出了我们关于如何从日益增加的各种组学数据以及以计算机模型为导向的系统方法中获取知识，从而进一步在哺乳动物系统生物技术框架内以精确和有针对性的方式实现下一代CLD。
CHO细胞系开发新趋势和工程时间轴
自1987年首次批准重组组织纤溶酶原激活剂(rTPA)以来，CHO细胞其性能特性被不断优化，其产量和效价大幅提高，达到10 g/L 。为了详细的概括CHO细胞CLD&E的发展，我们对相关的268篇文献进行了研究。通过对大量文献的分析，结果显示，大家关注的方向主要有三个领域:(i)提高细胞生产力，(ii)控制产品质量和(iii)确保细胞系稳定性。最初的几十年，大量的工作致力于适用于生产的细胞系开发：生物制品的产量高度依赖于为数不多的个别细胞系。持续的载体设计改进和克隆筛选策略显著地提高了产品的产量。另外CHO 细胞通过调节细胞代谢，蛋白分泌途径，抑制细胞凋亡等途径实现了单个细胞产量的提升。目前，CLD发展的方向侧重于目标产物的质量。分析技术的进步使得产品属性细微变化检测成为可能，诸如依赖于宿主细胞本质特性的蛋白质糖基化差异，电荷异质性都能很好地检测，对与产品质量的理解和控制正在深入的研究。尤其是，有不少研究在集中探讨CHO细胞产物的N-糖基化修饰，例如，在过去的十年中，关于突变引起糖链品种中缺乏特定糖分子的研究日益增加。这一趋势的进一步拓展归咎于生物类似药的进一步发展，因为生物类似药要求所生产的产品与原研药有高度相似的物理化学特性。最近几年，长期稳定，高效生产，产品均质性良好成为细胞株开发筛选的额外标准。综上所述，CLD的主要研究方向是从生产力转向产品质量，并在不久的将来进一步转向细胞系整体的稳定性（图1a）。
CHO细胞系开发与工程技术
CHO细胞系开发的进展
传统意义上，CHO CLD遵循一个完善的开发程序，其中关键步骤包括重组基因转染、适应特定培养条件、基因扩增和单克隆分离。在预先适应的无血清/化学组分培养基中悬浮培养适应，随后进行单克隆化是最为广泛的建立宿主细胞系的策略。随着目标基因的引入，生产克隆株将进一步的依靠特定基因扩增系统常用的Dhfr-MTX ，Gs-MSX 系统对产生的克隆体进行广泛筛选，以在不同规模下，根据产量、质量和长期稳定性，筛选出性能最佳的克隆体。尽管总体上产生工业化生产细胞株的实质策略并没有多大改变，但是整体进程由于高通量，集成微流体机械的使用，自动化控制系统，高通量分析系统的引入，使得单克隆化，克隆扩增，深孔板培养，产品属性分析，乃至最后的数据分析更加便捷高效，极大的提高了生产效率。
另外在CHO细胞系克隆筛选中，不少研究集中精力关注高效表达载体的设计（如图1b）.为了实现这一目的，强启动子被用来驱动基因的高效表达，而弱启动子控制选择基因，增加了系统的选择压力。有效调控元件也广泛用于表达系统，其中包括强效病毒启动子（CMV和SV40）,哺乳动物强效管家基因启动子，(β-actin, EF1a, CHCF, CHEF1) ，染色质绝缘体(S/MAR) ，无所不在的染色质开放元件(UCOE)，抗阻遏元件，以及优化的杂交元件等。
CHO细胞系工程化进展
在众多提高宿主细胞性能的方法中，与蛋白质生物合成、翻译后加工和分泌途径相关的基因的靶向过表达是常用的细胞工程技术之一（如图1b）。相对于过表达，小干扰RNA技术已经成为一种通过降解目标mRNA下调目标表达的有效策略。将含有20-25个碱基的双链RNA导入细胞或在细胞中稳定表达后，经过处理的单链RNA构成激活复合物以及RNA诱导的沉默复合体结合在靶分子上，实现mRNA的剪切。这种siRNA技术已被用于细胞株工程化，以提高其在抗凋亡、代谢和糖基化方面的产量和质量等属性。除了siRNA技术，由于许多内源性mirna在转录后广泛调控基因表达，因此microRNAs在细胞工程中也受到越来越多的关注。更吸引人的是，mirna在跨物种转录调控中具有良好的保守性，这表明它们有望成为实现增强CHO工程细胞表型的目标。通过过表达或者抑制特定的miRNA,可以同时调控蛋白质合成，分泌，细胞周期，代谢等多个途径，从而达到提高产量的目的。因此，miRNA技术可以对特定表型进行全局调控，而siRNAs则针对特定的mrna。
另一项有前景的细胞工程技术是敲出染色体上不利基因。传统的基因敲出方法是在进化过程中观察到的通过暴露于诱变剂引起的可遗传失活的突变。CHO细胞中典型的代表是DXB11和DG44细胞系，它们分别来自于诱变剂诱导的Dhfr基因的失活和缺失。虽然传统的诱变依赖于随机突变过程，但目前的敲除策略大多利用基于序列识别的靶向基因编辑技术和人工核酸酶，包括锌指核酸(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)和有规则间隔的短回文重复簇簇(CRISPR / Cas9)系统。ZFNs和TALENs使用核酸酶直接结合DNA，CRISP/Cas9系统基于碱基互补配对guide RNA识别特异性互补碱基对和Cas9核酸内切酶对DNA进行切割。所有系统均诱导序列特异性DNA双链断裂，然后修复受损DNA，产生靶向基因敲除。近年来，CHO-K1SV细胞内的内源性Gs基因被敲除从而产生改良的宿主细胞系，具有较高的选择性和产率。除了用于删除某些宿主基因，这些人工核酸酶技术还能够及时插入特定序列或将大型DNA序列交换到预定的基因组位置。集多重优势于一身，现在可以在CHO细胞中以高精确度和可控性插入GOI，这样不仅可以减少基因组和转录组的变异，还可以提高亚克隆之间的可预测性。
图1CHO细胞系开发与工程(CLD&E)的历史趋势及其实现方法
CHO细胞系开发与工程应用
生产为导向的应用
正如前面提到的，CHO CLD&E的主要关注点是提高单细胞产量(281项调查研究中超过80%的关注这一点)。表达载体可以通过结合启动子、增强子等多种调控因子来提高产物产量。尽管真核生物基因表达的调控相对于微生物而言较为复杂，但基于统计和人工神经网络模型，设计合理的合成启动子，如调控元件组成、核苷酸置换等，可以进一步提高启动子区域的转录。为了进一步提高基因表达水平，还可以根据宿主细胞对载体中转基因序列和信号肽序列的密码子序列进行优化。
宿主细胞工程进一步提高了CHO细胞培养物的产量，主要涉及抗凋亡/促增殖、高效代谢重组和改善分泌途径。例如，ZFN靶向删除两个著名的促凋亡基因BAK和BAX，使抗体产量增加了2 - 5倍。此外，分泌途径工程通过解决蛋白质加工过程中的翻译、易位、折叠和分泌等瓶颈，提高了产量。人信号受体蛋白SRP14的过表达有效地缓解了翻译阻滞，使难表达抗体的产量比对照高4 - 6倍，而对细胞生长的影响不大。最近通过功能筛选组成想表达miRNA对CHO细胞产量的影响，miR-557可以使CHO对难表达的抗体表达量提升两倍。
质量为导向的应用
CHO细胞工程已实现了广泛的产物糖基化修饰。利用ZFN技术成功敲出基因组中Fut8 基因，产生Fut8 阴性CHO细胞系，使所表达抗体缺乏核心岩藻糖基化。同样的，组合敲除Slc35c1 (GDP-fucose)和Slc35a1 (CMP-sialic acid)两种转运蛋白，产生去岩藻糖化和去唾液酸化的抗体。另一项有趣的研究广泛产生了一系列具有均质N寡糖谱的CHO突变体，通过去除一组19个糖基转移酶，无论是单独的还是联合的，从而为可能的治疗蛋白重新设计提供了平台。然而，与N -糖基化不同，尽管O -糖基化在一些重组蛋白(如促红细胞生成素(EPO)和人肿瘤坏死因子受体(p75) Fc融合蛋白(TNFR:Fc)中可能发挥作用，但CHO细胞中的O -糖基化工程相对较少。
与N -糖基化类似，治疗蛋白氨基酸序列的改变可能会影响其疗效和安全性，因此非常有必要确保克隆不会导致序列变异。但是，基因不稳定的CHO细胞由于DNA模板的突变，转录错误，翻译错误和转录后修饰的不同，造成产物的不均一。特别是最近的一项研究发现，在稳转细胞株转染子中，28%含高GC频率的的基因拷贝中至少有一个点突变，这就强调了早期准确检测基因突变的重要性。为了解决这一问题，利用候选克隆的RNAseq数据，结合LC/MS对产物的cDNA序列进行映射，可以高精度地识别突变克隆。作为一种替代方法，克隆cDNAs的NGS可以通过扩增子介导或靶向RNA-seq进行分析，以方便在早期细胞筛选中实现高通量和自动化。
以稳定为导向的应用
除了生产力和产品质量，CHO生产细胞株的长期稳定性最近倍受关注，因为在长期培养过程中会发生不可预测的生产力下降。此外，这种不稳定问题在被认为下一代细胞培养平台的连续培养系统中变得尤为重要。与分批/补料分批培养相比，连续培养可实现细胞极高密度(100e6 cells/mL)下生长且显著提高产品产量和质量。另外连续培养可实现长期在位培养及产品在培养器皿中停留时间短。生产力下降的主要原因是基因拷贝数的丢失、启动子区域的甲基化以及基因周围组蛋白的修饰，从而导致基因沉默。例如，CMV启动子区CpG二核苷酸的甲基化被认为是长期不稳定的主要原因，因为CMV启动子上游的高甲基化频率与CHO生产细胞系的产量下降具有很强的相关性。后续研究证实无CpG序列的 CMV启动子的可以使CHO稳转细胞系更加稳定，更适于长期培养。然而，尽管表达载体元件有了很多改进，基因组中的转基因整合位点仍然会影响CHO细胞的生产稳定性。因此，我们需要知道理想的基因整合位点，即所谓的“热点”，以确保稳定生产，质量均匀。为了识别这类基因组热点，最近提出了一种用于哺乳动物细胞系工程的多点整合的平台，可产生数百个主克隆，并在长期培养过程中监测其表型，从而确定导致稳定克隆的转基因整合位点
哺乳动物系统生物学技术用于定向和精确的CHO细胞系开发和工程化
将自动化和高通量技术用于CHO CLD中可以快速生产和筛选大量克隆，同时生成大量表征数据。然而，以往这些方法仍然是依靠经验的和随机的。在这方面，近年来随着高通量组学数据分析和系统建模框架的可用性等技术的发展，使我们能够基于CHO细胞的背景知识，以更合理的方式对CHO细胞系进行工程化。（如图2）
图2哺乳动物系统生物学技术框架，用于识别CHO细胞中的工程化目标
随着对多个CHO细胞系基因组序列的深层认识，现在已经可以精确的分析CLD过程中多个细胞系基因重排，基因扩增和丢失的深度原因。此外，它还加快了高通量组学数据的使用，包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以表征CHO细胞系和识别工程化目标。例如，高产量和低产量CHO细胞之间的蛋白质组学比较分析表明，重组产物合成需要高水平的谷胱甘肽。后续研究开发了稳定的过表达半胱氨酸连接酶修饰亚基的(GCLM)的CHO细胞系，从而使抗体产量提高70%。
此外最新的测序技术阐述了CHO细胞翻译的全景图，使得我们对生产工具CHO翻译的负荷有了更深层次的认识。尽管单个组学数据已经成功地用于指导CHO细胞开发/工程，但是组合多层组学数据集仍然是一个挑战。在这方面，最近的一项研究成功地提出了一个结合多组学数据集的系统框架，揭示了野生型和生产CHO细胞系之间的之间的整体基因重排。特别的，这项研究强调，超过40%的转录组差异发生在基因组水平，而不是表观遗传和/或调控机制，如果不整合跨多个层次的组学数据集，这些机制将无法阐明。
CHOCLD&E包含了大量的复杂性，通常需要一个定量的方法，包括理论和实验。虽然多组学数据集提供了在特定时间跨越细胞层次结构的多个层次的各种细胞进程的快照，但在计算模型中，可以机械的将基因型与表现型联系起来，填补了基因型与表型无法对应联系的空白。
在这方面，最近重建的CHO大规模基因组模型可以解释各种代谢和分泌途径中的所有可能成分，如基因、酶、蛋白质和代谢物。重要的是，该模型将作为框架，集成不同的多组数据，并以此知识为基础识别细胞工程化目标。如，通过将转录组学数据与CHO基因组规模模型相结合，就有可能识别出代谢工程化目标，用于基因操作以提高细胞生产力。（如图3）
图3基于模型导向的转录组学应变设计用于识别细胞工程目标
如前所述，开发高性能CHO细胞系的主要标准之一是在相关基因组位点上传递感兴趣的GOI，这将导致递送基因在培养过程中的一段时间内持续高表达。尽管CLD中的大多数方法依赖于随机基因整合，但现在可以在特定的基因组热点上精确插入目标基因，从而产生具有所需性状的细胞系。为此，多组学数据集，如RNA-seq，核糖核酸-seq，扩增子-seq, dna -seq和ChIP-seq可以系统地分析CHO细胞的表观遗传和转录组之间的关系，识别表观遗传记忆较少的基因组热点。如今，越来越多可用的基因编辑工具，如CRISPR/可以利用Cas9、TALEN或ZFN在需要的位置插入基因。
结论
在过去的三十年里，由于先进的CLD平台和通用的细胞工程技术，CHO细胞株的产量已经显著增加。传统上，CHO细胞系的开发主要集中在对随机产生的突变体的广泛细胞筛选及其评价。展望未来，CHO基因组的可用性使细胞目标的精确和有针对性的基因组工程化成为可能，这些目标的实施建立在对细胞系深度系统认知的基础上。因此，我们相信，在未来，高通量多组学数据和计算机模型预测将得到充分利用，来指导哺乳动物细胞系统工程化，在生产率、质量和稳定性方面都有显著提高。
