结核分枝杆菌(TB-SA)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒(赛普克(结核分枝杆菌抗体(IgG)检测试剂盒(酶联免疫法)))
【生产厂家】成都永安制药有限公司
【批准文号】国药准字S3112
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】48人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【英文名】Mycobacterium Tuberculosis Nucleic Acid Amplification (PCR) Fluorescence Diagnostic kit
【汉语拼音】Jiehefenzhiganjun hesuan kuozeng (PCR) yingguang jiance shijihe
【正文】
[用途]
本试剂盒采用荧光实时PCR技术。特异性扩增结核分枝杆菌的核酸靶序列，适用于痰标本的结核分枝杆菌的检测，用于肺结核病的辅助诊断。
[试验原理]
本试剂采用一对结核分枝杆菌核酸特异性的引物，用PCR方法对分泌型蛋白TB-SA的基因序列进行体外扩增，扩增区域位于TR DNA59～34821。扩增产物与荧光染料SYBR Green相结合，荧光信号强度与扩增产物的量成正比，并且与原始的模板量相关。扩增产物的特异性可以通过产物的融解曲线来判定。
[主要组成成份]48人份/盒
1.样本DNA提取试剂
(1)去污染液（10倍浓缩） 30ml×1瓶(使用前请作稀释)
(2)DNA提取液 15ml×1瓶
(3)PBS缓冲液（10倍浓缩） 6ml×1瓶(使用前请作稀释)
(4)醋酸盐溶液 1.5ml×1管
(5)TE缓冲液 4ml×1管
2.RT-PCR试剂
(1)PCR反应混合液750ml×1管
(2)PCR引物F80ml×1管
(3)PCR引物R80ml×1管
(4)阳性对照品 1ml×1管
(5)临界对照品 1ml×1管
(6)阴性对照品 1ml×1管
(7)分子生物专用水500ml×1管
3.临床单位自备试剂:异丙醇，70%乙醇
[适用仪器]
本试剂盒适用于ABI5700、ABI7700、ABI7900；Roche LightcyCler；Cepheid Smart Cycler等各种实时荧光PCR仪。
[样本要求]
1.痰标本
采集、存放、运输:以清晨的第一口痰为宜。先用清水漱口，请患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封，即可送检。待测样本在2-8℃保存不应超过24小时，-20℃保存不超过三个月，-70℃以下可长期保存。应避免反复冻融。采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进运输。
处理:将痰样(3-5ml)转入离心管中，加入同体积的去污染液。用手震荡离心管1分钟，放入震荡器上轻微震荡20分钟，充分混匀。5,000rpm离心15分钟，弃上清液。用1ml PBS缓冲液洗涤沉淀，13,000rpm离心10分钟，弃上清液，进行DNA提纯（离心沉淀物可在-20℃保存备用）。
2.对照品的处理
分别取500ml阳性、临界和阴性对照品13,000rpm离心10分钟，弃上清液，进行DNA提纯。
[试验方法]
1.临床样本DNA的提纯
1）向样本和对照品沉淀中各加入200ml DNA提取液，充分混合，100℃煮沸15分钟。
2）13,000rpm离心10分钟，将上清液（约180ml）转移至干净的1.5ml离心管中。加入20ml醋酸盐溶液，然后加入1ml预冷的100%异丙醇，颠倒混匀后置-20℃沉淀2小时。
3）13,000rpm离心10分钟，弃上清液，用1ml 70%的乙醇洗涤沉淀。
4）13,000rpm离心5分钟，弃上清液，室温干燥15分钟。
5）以60ml的TE缓冲液融解DNA，此样品即可用于PCR扩增。
2.临床标本的检验
1）主反应试剂的配制（准备区）
反应数 反应混合液 引物F 引物R分子生物专用水
每个反应13.2ml1.25ml1.25ml7.3ml
N个反应13.2ml×N 1.25ml×N 1.25ml×N 7.3ml×N
按照上表将各组份混合即为该次试验的主反应试剂。混匀离心后，向每个反应管加入23ml，分装完毕后转移至样品处理区。
2）加样(样品处理区)
在设定的反应管中分别加入2ml临床标本、阳性对照品、临界对照品和阴性对照品提取的DNA样品。离心10秒后放入PCR仪。
3）PCR扩增(检测区)
请按荧光实时PCR仪使用说明操作。PCR扩增循环程序设置如下:
第一步:95.0℃ 15分钟
第二步:
第三步:按0.2℃/秒从65℃升温至95℃。(在此过程中根据荧光信号的强度和相应的温度绘制的曲线称为融解曲线。大多数荧光实时PCR仪具有融解曲线功能，只需选此项，不需要单独设置。)
[质量控制]
阈值由预实验确定，质量参控品的阈值应满足以下条件:
阴性对照品的Ct＞35，或者Ct≤35.0，并且Tm≠88℃±1℃；
阳性对照品的Ct为22.0≤Ct≤32.0，Tm＝88℃±1℃；
临界对照品的Ct为32.0≤Ct≤35.0，Tm＝88℃±1℃。
[结果判断]
Ct≤35.0，Tm=88℃±1℃者为阳性
Ct≤35.0，Tm≠88℃±1℃者为阴性
Ct＞35.0，为阴性
[产品性能指标]
1.灵敏性:结核分枝杆菌检出限度10-100个结核菌，线性回归R2＞0.96。
2.特异性:特异性扩增结核分枝杆菌TB-SA基因，与以下分枝杆菌和常见致病菌无交叉反应:海鱼分枝杆菌，革登氏分枝杆菌，瘰分枝杆菌，龟脓分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，草分枝杆菌，胞内分枝杆菌，鸟分枝杆菌，猿分枝杆菌，偶然分枝杆菌，母牛分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，布氏杆菌，肺炎球菌，百日咳菌，大肠杆菌。
3.精密度:试验内，试验间CV＜10%。
4.准确性:大于或等于100基因拷贝时的回收率为80%-130%。
[注意事项]
1．进行操作的人员应具有PCR经验并进行专门培训。
2．检测过程分三个区域进行:一区进行PCR反应体系的配制；二区进行样品处理和加样等；三区进行PCR扩增，荧光检测和结果分析等。各区使用的仪器设备，工作服等应独立，避免扩增产物对环境的污染。
3．本试剂盒的反应体系组成已经在多种主要的荧光实时PCR仪上进行优化验证，在实际操作中无需作任何调整。荧光信号的采集和数据收集请参照所使用的机型进行设置。
4．主反应试剂:在PCR试剂准备阶段，除核酸模板之外，PCR反应的其它组份可根据实际用量按比例混合，然后再分装至各个反应管。此种方法克服了向同一反应管多次加样而引起的操作错误或加样误差，有效地降低了各反应管之间的差异。鉴于加样损失的影响，主反应试剂的配制量应稍多于实际用量。
5．试剂盒各组份在使用前应充分融化，混合均匀并低速离心。不同批号的试剂请勿混用。
[规格]48人份/盒
[储存条件]请置-20℃保存。
[有效期]6个月。
【批准文号】
结核分枝杆菌(TB-SA)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒(赛普克(结核分枝杆菌抗体(IgG)检测试剂盒(酶联免疫法)))
