乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)酶免检测试剂盒
【生产厂家】上海科华生物工程股份有限公司
【批准文号】国药准字S20020028
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】16人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【药品名称】
乙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）-酶免检测试剂盒
【原理与用途】
本试剂盒采用聚合酶链式反应(PCR),通过扩增血清中的乙型肝炎病毒特异的DNA片段来检测人体内乙型肝炎病毒的感染状况,在PCR 扩增体系中采用UNG/dUTP防污染机制，扩增后的产物采用"ELISA模式化"杂交方法进行检测。
本试剂盒适用于定性检测血清标本中的乙型肝炎病毒核酸，检测的灵敏度为104拷贝/ml。可作为乙型肝炎的辅助诊断方法。
【试剂盒规格与组成】
1 试剂盒规格 16人份/试剂盒
2 试剂盒组成
2.1 样品处理试剂
［样品裂解液］3.0ml × 1瓶含有硫氰酸胍的溶液
［样品提取液A］20μl × 1支含有助沉剂的溶液
［样品提取液B］1.5ml × 1支含有异丙醇的溶液
2.2 PCR扩增反应试剂
［PCR混合物］540μl × 1支含有一对引物、dNTP、UNG、Taq酶的溶液
［氯化镁溶液］100μl × 1支 含有氯化镁的溶液
［液体石蜡］0.9ml × 1支 含有液体石蜡的溶液
2.3 对照品
［阳性对照］50μl × 1支 含有0.1% NaN3的HBV DNA阳性的混和人血浆
［弱阳性对照］50μl × 1支含有0.1% NaN3的HBV DNA弱阳性的混和人血浆
［阴性对照］50μl × 1支 含有0.1% NaN3的HBV DNA阴性的混和人血浆
2.4 杂交检测试剂
［变性反应液］1.0ml × 1支含有氢氧化钠的溶液
［杂交反应液］2.5ml × 1瓶含有缓冲液及硫氰酸钠的溶液
［洗涤液(10X)］18ml × 1瓶含有缓冲液、Tween-20及ProClin300的溶液
［酶结合物］2.5ml × 1瓶 含有缓冲液及链霉亲和素过氧化物酶的溶液
［显色剂A］3.5ml × 1瓶 含有缓冲液及过氧化氢的溶液
［显色剂B］3.5ml × 1瓶 含有缓冲液及四甲基联苯胺的溶液
［终止液］3.5ml× 1瓶 含有硫酸的溶液
［PCR反应管］0.5ml ×16支DNase free的薄壁PCR反应管
［杂交反应条］8孔 × 2条 包被有特异探针的8孔可拆式微孔板条，置于放有一包干燥剂的铝箔袋中
［反应板框架］1只
［粘贴纸］1张
2.5 说明书 1份
2.6 自备试剂
［75%乙醇］10ml 用灭菌纯化水、无水乙醇(分析纯)配制,-20℃预冷
【样本种类、采集和保存方法】
样本:采血后必须尽快分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用的无菌微量离心管中。样品如不及时检测，应于-20℃至-80℃冻存。血清标本应于冷冻条件下运输。
【仪器】
PE9600、PE480等各类PCR仪；离心机；洗板机；酶标仪等。
【操作步骤】
1 样本处理
用带滤芯吸嘴吸取50μl待测标本于0.5ml PCR反应管中,加入100μl样品裂解液和0.5μl样品提取液A，振荡混匀，室温放置5分钟以上，加50μl样品提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟以上，6000g离心6分钟，弃上清，尽量不留残余,再加入50μl样品裂解液，振荡混匀，6000g离心5分钟，用带滤芯吸嘴吸掉上清，尽量不留残余,沉淀中加400μl 预冷75%乙醇(-20℃)，颠倒混匀，6000g离心5分钟,弃上清，将PCR反应管垂直静置1-2分钟，用移液器小心吸去残余乙醇，切勿吸去管底白色沉淀（沉淀无需干燥）。
2 核酸扩增
PCR反应液准备：在PCR混合物中加入60μl氯化镁溶液，充分混匀，离心数秒，即为PCR反应液。
PCR扩增：用带滤芯吸嘴在上述 PCR反应管中加入 30μl PCR反应液和 30μl液体石蜡,离心数秒，置扩增仪上扩增。
37℃ 10分钟
95℃ 10分钟
94℃ 45秒┐
55℃ 45秒｜－35个循环
72℃ 45秒┘
72℃ 5分钟
3 杂交检测
3.1 准备：利用PCR热循环时间，取出杂交反应板条、杂交反应液、酶结合物、显色剂、终止液等，室温平衡。
3.2 变性：取30μl变性反应液加入到扩增完毕的PCR反应管中，混匀后离心数秒。
3.3 杂交：加杂交反应液100μl于杂交反应板条各孔中,再取上述变性产物(反应管下层红色部分)25μl加到反应板各孔中,振荡混匀，置37℃恒温箱反应60分钟。
3.4 洗板（必须用洗板机）：
3.4.1 吸干弃去各孔中的反应液。
3.4.2 每孔加1×洗涤液(将10×洗涤液用纯化水按1:10稀释后使用，稀释前检查10×洗涤液应无任何沉淀物)至满，放置5～30秒后吸干，共5次。
3.4.3 将微孔反应板倒置于吸水纸上，拍去残余液体。
3.5 酶联反应：每孔加100μl酶结合物，置37℃恒温箱反应15分钟。
3.6 洗板：重复步骤④。
3.7 显色：每孔加显色剂A 50μl，再加显色剂B 50μl，振荡混匀,置37℃恒温箱反应10分钟。
3.8 终止：每孔加终止液50μl。
4 结果判断（比色法）：
选双波长450nm、630nm，以空白对照校零对每孔进行比色，记录其OD值。
Cutoff Value=0.15 + 阴性对照OD值（阴性对照OD值<0.05时按0.05计算，若>0.05则按实际值计算）
标本OD值小于Cutoff Value，判为HBV DNA阴性。
标本OD值等于或大于0.40，判为HBV DNA 阳性。
待测标本OD值位于Cutoff Value～0.40之间,须进行双管复测,如果复测后单管或双管OD值小于Cutoff Value,可判定阴性；如复测后双管OD值均大于Cutoff值，可判定为阳性。
质量控制:阴性对照OD值应小于0.2；阳性对照OD值应大于1.0；弱阳性对照OD值应大于Cutoff值。否则试验无效。
【注意事项】
1 待检新鲜血清若不及时检测,应保存于-20℃。
2 试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。
3 PCR操作各阶段应在不同实验室进行。
4 在试剂和标本准备阶段使用负压超净台。
5 应穿工作服，戴一次性手套（经常替换手套），使用一次性用品。
6 PCR操作人员应具有经验和受过培训。
7 操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%乙醇或紫外灯处理。
8 阴阳性及弱阳性对照为未处理的血浆,应和待检标本平行进行操作后方可进行PCR扩增。
9 每次实验必须设立阴性、阳性、弱阳性对照及空白对照（不加扩增产物）。
10 使用本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程操作。
11 阴、阳性对照应视为传染性物质对待，注意安全防护。
【试剂储存条件】
本试剂盒须于-20℃保存。
【有效期】
本试剂盒有效期为六个月。
