乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量测定试剂盒
【生产厂家】英科新创(厦门)科技有限公司
【批准文号】国药准字S0112
【剂 型】试剂盒
【规 格】24人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【药品名称】
乙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）荧光定量测定试剂盒
【英文或拉丁名】
Hepatits B virus DNA Quantitative Fluorescent PCR Detection kit
【汉语拼音】yi xing gan yan bing du he suan kuo zeng（PCR）ying guang ding liang ce ding shi ji he
【主要成分】1.标本提取试剂
提取液A1×750μl
提取液B1×750μl
提取液C1×750μl
2.PCR扩增试剂
PCR反应混合液1×1000μl
含酶管1×15μl
3.定量标准品
3.5×103拷贝/ml1×120μl
3.5×104拷贝/ml1×120μl
3.5×105拷贝/ml1×120μl
3.5×106拷贝/ml1×120μl
3.5×107拷贝/ml1×120μl
4.对照试剂
阳性对照1×120μl
阴性对照1×120μl
内对照 1×150μl
5.PCR薄壁反应管（0.2ml） 24支
【用途】
通过本试剂盒的使用对患者血液中的乙肝病毒DNA含量进行临床的检测和治疗过程监测。
【试验原理】
本试剂盒采用PCR扩增发夹式荧光标记检测技术，用荧光双波长实时检测体系，对乙肝病毒DNA进行闭管实时检测。本试剂盒的定量外对照梯度标准品及内对照都是通过DNA装甲病毒技术而研制出的装甲病毒DNA，二者均可以完全参与整个检测过程，使定量和防止假阴性达到最可靠的程度，实现了全程质控。本试剂盒根据定量外对照梯度标准品的工作曲线确定待测样品的HBV病毒含量，同时使用内对照监测样品提取过程和PCR反应体系的可靠性，防止假阴性结果；采用dUTP-UNG酶系统，防止因PCR产物污染而产生的假阳性，降低在低温情况下形成的非特异性产物以及引物二聚体。本试剂盒适用于乙肝病毒DNA感染的临床检测、治疗过程监测。
【适用仪器及所需物品】
荧光PCR仪 高速台式离心机 微型掌上离心机
超净工作台 旋涡振荡混合器 可调微量移液器及相应枪头
金属浴锅（含96℃量程）或水浴锅离心管架及1.5ml灭菌离心管
一次性PE手套、卫生口罩、凹凸袋等
【适用仪器】
本试剂盒适用于BIO-RAD icycler、RotorGene、ABI Prism7000、PE7700、PE5700等荧光定量PCR仪。PE5700及其他种类单色检测荧光PCR仪，使用时不做Joe内标荧光的检测，其余设置及结果判定均与双色荧光检测相同。
【样本要求】
注意：所有标本都应作为有传染性的物质处理
A：标本的采集和贮存
本试剂盒适用于血清或血浆标本。用肝素作为抗凝剂的血液标本不适用于本试剂盒。可使用EDTA或柠檬酸盐作为抗凝剂收集的血液。
必须在抽血后6小时内，室温下以1500g离心20分钟或者室温放置1小时，分离血清和血浆。将血清或血浆转移至一灭菌样品管内，贮存于2-8℃。如果标本72小时内不提取，则可将其冷冻贮存于-20℃或-80℃。避免反复冻融。
B：标本的运输
全血必须在2-25℃下运输。血清或血浆必须在2-8℃或冷冻状态下运输。
【操作步骤】
A：试剂准备——配液区
1.首先应将所有的试剂平衡至室温。每10人份PCR反应液配液标准为：取4μl酶液和400μlPCR混合液加入到1.5ml离心管中，盖上管盖颠倒混匀。配好的PCR反应液必须贮存在-20℃并在4小时内使用。
2.PCR反应液的分装。以每管40μl分装于0.2mlPCR薄壁反应管。
3.将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至标本提取处理完毕。
B：标本提取——提取区
1.确定所要提取的标本的管数（加上试剂盒中的5个梯度的外对照标准品和阳性、阴性血清两支标本）在离心管架上放置足够的1.5ml离心管。用标记笔在管壁上标上相应的序列号。
2.根据待提取标本总数，将内对照标准品与提取液A以1：5比例混匀。
3.向离心管中加入30μl混有内对照标准品的提取液A。
4.向每支离心管中加入相应标号的血清或血浆样品50μl。每次移液时应换枪头。振荡混匀5秒。
5.在每支管上标上方位标记，方位标记向外放入离心机内。室温12500g离心5分钟。这样沉淀就会落在有方位标记的一面。
6.用微量加液器将离心管中上清小心吸取（可以将枪尖插到与沉淀相对的管底部位吸取上清），尽可能地减少对沉淀的搅动（沉淀用肉眼可能看不到），弃上清。
7.再向每支离心管中加入25μl提取液B，盖严管盖。
8.振荡混匀15秒。沉淀不一定完全溶解，这对实验没有影响。
9.将各管置于96℃10分钟。
10.用微量加液器向每支1.5ml离心管中加入25μl提取液C，盖严管盖，振荡混匀5秒。
11.将各管置于96℃10分钟。
12.按每支管上方位标记，方位标记向外放入离心机内。室温12500g离心15分钟。如果不在当天PCR扩增，可将提取好的标本贮存于2-8℃，3天内有效，或贮存于-20℃或更低的温度6个月内有效。
13.用微量加液器向每支0.2mlPCR薄壁反应管中加入相应的提取标本或定量外对照品10μl。立即盖严管盖。
14.将已加入模板的0.2mlPCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
C：PCR扩增——PCR区
仪器的程序设定如下：
UNG酶温浴 53℃ 3分钟
预变性 95℃ 3分钟
循环设置（40个循环） 95℃ 1秒；53℃ 30秒
数据的采集点应设置在53℃30秒，荧光信号应设置为Fam和Joe。程序运行完毕，将0.2mlPCR薄壁反应管（闭管）取出放入凹凸袋封好口，按污染源高压处理。
【结果判定】
1.条件设定：
iCycler荧光PCR仪：对PCR结果进行分析时基线（baseline）取2－10个循环荧光信号（此值可根据仪器及实际情况调整，范围为2－14循环），阈值（threshold）为基线SD×10（此值可根据仪器及实际情况调整，参考域值设定参考原则，范围为SD×5－SD×15）。
ABI Prism7000荧光PCR仪：分析结果时，基线（baseline）取6－15个循环荧光信号，阈值的确定根据实际情况调整，参考域值设定参考原则。
PE5700荧光PCR仪：分析结果时，基线（baseline）取6－15个循环荧光信号，阈值范围为0.025-0.05（此值可根据仪器及实际情况调整，参考域值设定参考原则）。
其他定量荧光PCR仪：建议根据仪器操作并参考域值设定参考原则，参考仪器缺省设定值对域值进行设定。
域值的设定应参考以下原则：1、域值应高于阴性对照荧光值2、域值应处于阳性对照及定量外对照品荧光值的对数上升区3、域值的确定应使得定量外对照品的线性处于最接近1的状态。
2.定量结果判断：
用5个定量外对照品作标准曲线。仪器自动以对照品的拷贝数的对数值为横坐标，以其相应的CT值为纵坐标自动作出标准曲线。仪器根据血清样品的CT值，输出血清样品所含病毒DNA的拷贝数。
【试验方法的局限性】
本试剂盒只适用于血清或血浆标本，且血清或血浆的收集不能用肝素作抗凝剂。
【质量控制】
1.仪器所作出的定量外对照品的标准曲线的线性拟合度应大于等于0.99，否则视为定量结果无效。
2.阳性对照的Fam探针的CT值应大于15且小于30，相应内对照检测Joe探针CT值应大于21.0且小于27.0，否则该实验结果视为无效。
3.阴性对照的Fam探针CT值应为0或40，相应内对照检测Joe探针CT值应大于21.0且小于27.0，否则该实验结果视为无效。
4.在循环结束后仍无任何扩增的样本，在个仪器上个有不同显示：PE Gene Amp5700和PE Gene Amp7700上的显示为40，打印文本显示为0拷贝/ml；BIO-RAD iCycler上CT值显示为0，打印文本不显示该样本信息。
【注意事项】
1.本试剂盒仅限于体外诊断使用。
2.本试剂盒适用于以EDTA或柠檬酸盐作为抗凝剂收集的人血清或血浆。肝素因对PCR有抑制作用，因而用肝素作为抗凝剂而收集的血清或血浆不适用于本试剂盒。
3.严禁在实验室饮食和吸烟。在操作本试剂盒试剂和处理标本时需戴一次性手套，护目镜，进入实验室要穿工作服。操作结束后应彻底洗手。
4.为避免在移液过程中可能带来的污染，建议使用一次性的枪头。
5.不要将贴有不同标签的试剂混合使用，也不要将不同批号的试剂混合使用。
6.废弃物和废弃的试剂的处理应按污染源高压处理。
7.不要在效期后使用本试剂盒。
8.工作人员在实验室内的走动方向应为从配液区至提取区至PCR区流动，三个不同的区应各自配备一套专用的实验器具，各区间的实验器具不能在区间流动更不能混用。试剂配制用的配套用品和辅助材料不能用于标本制备，也不能用于移取、处理扩增的DNA或其他来源的靶DNA。PCR区的配套用品和辅助材料必须一直放在PCR区不能取出以防止PCR扩增子的污染。工作人员在每个区都应该戴手套，离开时必须换手套。
9.操作时标本必须作为有传染性的物品来对待，操作程序必须遵循实验室安全程序。用消毒液彻底清洁消毒所有工作面，所有接触标本的用品和材料在丢弃前均应高压灭菌处理。
10.在操作提取液B时要穿戴护目镜、工作服和一次性手套。避免这些物质接触到皮肤、眼睛、粘膜。如果不小心接触了，应立即用大量的水冲洗。如果不处理则可能带来烧伤。如果这些试剂溅出来了，应用水稀释后擦干。
11.标本处理阶段应每吸取一次液体换一个枪头，以防止标本间的潜在交叉污染。
【包装及规格】
24T/盒
【贮藏】
贮存于-20℃
【有效期】
有效期为12个月，请于效期内使用。
